花粉管通道法介导aiiA和TuMV-CP基因转化大白菜的研究

摘要

大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)原产于中国,是我国蔬菜栽培中分布最广,种植面积最大的蔬菜作物之一,在我国尤其是北方地区的“菜篮子工程”中占有举足轻重的地位。但是,近年来随着大白菜栽培面积的不断扩大和种植年限的不断增加,软腐病、病毒病等许多病害有加重发展的趋势,严重地影响了大白菜的生产。本研究通过花粉管通道法将aiiA,TuMV-CP基因导入大白菜,期望获得抗病转基因植株,为大白菜的抗病育种奠定理论基础。研究结果如下:
　　 1.根据aiiA基因的已知序列,克隆该基因,以植物表达载体pBBBast+为目标载体,通过酶切、连接、筛选、鉴定等操作构建了植物表达载体pBBBast-aiiA。
　　 2.本研究利用Pet-29a构建了pET29a-aiiA原核表达载体,制备了E.coliBL21(DE3)-pET29a-aiiA工程菌。通过对融合表达条件(如温度、IPTG浓度及诱导时间)进行优化并用SDS-PAGE检测,结果表明,在20℃低温,0.8mmol/LIPTG诱导表达25h条件下可获得含量最高的可溶性AiiA蛋白51.1μg/Ml。
　　 3.纯化后的AiiA蛋白和破壁上清液经活性检测和抑菌抗病实验,结果表明均具有良好的AiiA活性和良好抑菌效果。
　　 4.通过花粉管通道法,将aiiA,TuMV-CP基因转入大白菜“二牛心”品种中。对转基因植株进行PCR和PCR-Southem验证,获得了转aiiA基因大白菜5株,转化率为0.0242％;转TuMV-CP基因大白菜29株,转化率为0.1531％。