马铃薯晚疫病菌的长期保存与特异性SCAR标记的开发

摘要

马铃薯是世界上继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。2008年被联合国宣布为“国际马铃薯年”(IYP)更突显出马铃薯在全球粮食系统中的重要地位，我国马铃薯的种植面积与产量均居世界首位，但是由卵菌门致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]引起的马铃薯晚疫病一直威胁着我国马铃薯产业的发展。
　　 由于马铃薯晚疫病菌的腐生能力弱，在干燥、过高或过低的温度条件下很容易死去，所以很难利用其他病原真菌的长期保存法来保存晚疫病菌。本研究利用矿物油对2006～2008年采自吉林省和黑龙江省的73株马铃薯晚疫病菌进行保存，测定了在不同保存时期的马铃薯晚疫病菌的生存力。结果表明在矿物油中保存的所有马铃薯晚疫病菌中，94.6％的菌株生存。实际上，在矿物油中保存4、5、6、10、12、13和15个月后菌株的生存率是100%；保存7个月后菌株的生存率是80%；保存8个月后菌株的生存率是90.5%；保存9个月后菌株的生存率是91.7%；保存11个月后菌株的生存率是88.9%；保存14个月后菌株的生存率是75%。本试验采用离体接种的方法测定了不同保存时期马铃薯晚疫病菌的致病性，计算了矿物油保存后生存菌株的复合寄生适合度。结果表明，平均病斑面积是8.68 cm2，平均侵染率是1.0，平均产孢能力是5031个孢子囊/cm2，平均复合寄生适合度是40926。在矿物油中保存的马铃薯晚疫病菌的致病性分布在14806～414474个孢子囊/cm2。因此，矿物油保存方法能够适用于马铃薯晚疫病菌的长期保存。
　　 潜伏于马铃薯薯块中的晚疫病菌是来年晚疫病发生的最主要初侵染源，马铃薯晚疫病在植株上发病初期很难鉴定，本研究根据已报道的晚疫病菌基因序列设计了一对特异性引物LB-3F/LB-3R，并利用此引物扩增从晚疫病菌和其他常见致病菌(大豆疫霉菌、马铃薯早疫病菌、腐霉菌、镰刀菌、灰霉菌、立枯丝核菌)中提取的基因组DNA。扩增结果显示在所扩增的马铃薯晚疫病菌中发现了大约150 bp特异性DNA片段，而其他菌株均未扩增出目的条带。将此特异性片段克隆、测序并与已公布的P.infestans A1交配型菌株的特异片断(573 bp)进行比对。结果显示本试验插入的马铃薯晚疫病菌特异性片段大小为156 bp，测定基因序列与P.infestans A1交配型菌株的特异片断(573 bp)的中间段基因序列(259 bp～414 bp)之间有99%的相似性。本试验利用从特异性片段中收回基因组DNA合成探针，并利用此探针对马铃薯晚疫病菌及其他致病菌基因组DNA进行Southern杂交验证，结果只有晚疫病菌杂交出片段，其他菌株均无，这与PCR扩增结果一致。
　　 为了鉴定不同潜伏期马铃薯晚疫病的存在，本试验利用该特异性引物分别扩增从不同接种时期(0、4、8、12、24、48、72、96、120 h)马铃薯叶片、茎、薯块上提取的基因组DNA。结果显示，在叶片上接种4h之后提取的基因组DNA中扩增出目的条带，在茎上接种48 h之后基因组DNA中扩增出了目的条带，在薯块上接种24 h之后提取的基因组DNA中扩增出了目的条带。以上结果表明，即使植物表面没有明显患病症状，但植物的各组织中可能潜伏马铃薯晚疫病菌。本试验进一步将PCR扩增产物进行PCR-Southern杂交，结果与PCR扩增结果一致。以上研究结果说明此SCAR引物对马铃薯晚疫病菌的侵染过程研究和马铃薯晚疫病菌的快速检测提供科学依据。