人参特异性RAPD标记的DNA片段、鉴别人参的SCAR标记特异性引物对及方法

摘要

本发明公开了一种人参特异性RAPD标记的DNA片段、鉴别人参的SCAR标记特异性引物对及方法。本发明通过随机扩增多态性DNA方法筛选人参特异的DNA片段，再经回收，克隆及测序得到特异序列；根据特异性序列设计特异性引物1和2，将RAPD标记转化为稳定的SCAR标记，在SCAR标记快速分子检测人参的方法中，可扩增并获得特异带型，为约300bp、130bp大小的2个DNA片段。但在西洋参、三七、景天三七、栌兰、珠子参、水田七、姜黄、竹节参、商陆以及所研究的58种其他中药材中则无该特异性带型，均为阴性扩增。使用此方法鉴别人参的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。可用于人参药材的快速鉴定。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，具体涉及到一种利 用SCAR技术鉴定人参的特异性引物对及方法。

背景技术

人参为五加科Araliaceae人参属Panax植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和 根茎，多于秋季采挖，洗净经晒干或烘干。栽培的俗称“园参”；播种在山林野生状态 下自然生长的称“林下山参”，习称“籽海”。主产于我国东北三省和朝鲜，被誉为 “百药之王”；具有大补元气、强心固脱、补脾益肺、安神生津的功效；用于体虚欲 脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴等证；五加科人参属主要药用植物为： 人参Panax ginseng C.A.Mey.、西洋参Panax quinquefolium L.和三七Panax  notoginseng(Burkill)F.H.Chen ex C.Chow&W.G.Huang；西洋参主产于美国威斯康辛州 和加拿大安大略省；我国市场上的西洋参主要有两种：一种是进口，一种是引进种植。 三七主产于云南、广西。三者都是我国常用的珍贵药材，但其价格差异大；所以,市场上 经常出现用其它根类药材，如商陆根、栌兰根等充作人参。伪品不仅不具有药理作用， 甚至可能产生毒副作用。

传统的分析鉴别方法，是根据形态和组织结构特征和化学成分鉴别，而这些传统的 鉴别方法干扰因素较多，易受环境和植物本身的影响和限制；随着科学的不断前步，应 用DNA分子标记技术鉴定中药材及其饮片，取得了快速地发展，在中药材真伪鉴别中发 挥了重要的辅助鉴定作用。

RAPD(random amplified polymorphic DNA)标记技术是建立在PCR基础之上，对整个 未知基因组序列进行多态性分析，已经广泛应用于品种鉴定、遗传分析等研究，尤其适 合于寻找不同样品间的DNA差异。Shaw等首先采用RAPD方法区分人参属3种药材人 参、西洋参、三七。RAPD为10碱基的随机序列，通过PCR反应扩增基因组DNA，由于 不同基因组DNA序列碱基位点具有明显的差异，在不同区段上与引物发生结合的位点也 不相同，因而扩增条带的数量、强弱等特征均不同，产生不连续的DNA产物，获得较多 的条带信息，从而使不同的种表现出多态性；RAPD的优点是所需DNA量极少，操作简 单，设备要求低，但是由于RAPD引物只有10bp,退火温度较低，重复性相对较差。为了 避免这一不足，将其转化为稳定的SCAR(sequence characterized amplified regions)标记。将 RAPD转化成SCAR标记技术是1993年Paran和Michelmore提出并应用的，已广泛应用 于植物、生物等领域；SCAR标记是在RAPD的基础上，对其特异片段进行回收、克隆和 测序，根据测序序列设计特异性引物，并以此引物对基因组DNA进行PCR扩增。具有操 作简单、稳定、成本低等优点。张铭采用RAPD技术获得了铁皮石斛基因组DNA的特异 性SCAR标记，构建的特异性SCAR标记引物扩增出特异性SCAR片段，可以用于鉴别铁 皮石斛。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种人参特异性RAPD标记的DNA片段、鉴 别人参的SCAR标记特异性引物对及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述人参特异性RAPD标记的DNA片段序列如SEQ ID NO.1所示。该DNA片段可 用于制备鉴别人参的试剂。

所述鉴别人参的SCAR标记特异性引物对包括引物1和引物2，引物1和引物2是根 据权利要求1所述DNA片段设计的引物。优选地，所述引物1的序列为 5’-CCCGACTCAAAATCGAAGT-3’(SEQ ID NO.2)，所述引物2的序列为 5’-AAGCAAGAAGCAAGGGTAACATA-3’(SEQ ID NO.3)。

所述鉴别人参的方法是用上述引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增，若待测样品 获得2条特异性SCAR标记片段，则表明该待测样品为人参，所述2条特异性SCAR标记 片段中一条长度为280～320bp，优选300bp，另一条长度为100～150bp，优选130bp。所 述PCR扩增反应参数如下：PCR扩增反应体系总体积为25μL，PCR扩增反应体系包括： 5×Primer STAR Buffer(Mg²⁺plus)5μL，dNTPs mixture(2.5mM)2.5μL，引物 1(10μM)0.75μL，引物2(10μM)0.75μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara，2.5U/μL) 0.25μL，DNA模板1μL，无菌双蒸水补充至25μL；PCR扩增反应程序为:95℃预变性3 min,98℃变性10s，52℃退火15s,72℃延伸1min,30个循环后，72℃延伸7min，4℃ 保存。

本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物1和2，由于人参、西洋参及三七基因 组高度相似，要寻找其差异DNA片段是一个难点，因此本发明通过RAPD这个方法，获得 了人参有别于其它药材的差异性DNA序列，该序列是通过RAPD技术筛选获得的、仅在人 参中能获的特异性DNA片段，此前并未公开报道。本发明通过设计特异性引物通过PCR技 术获得了特异性标记的片段，结果可以将人参和其他药材区分。由于基因组的复杂性，该 引物对在人参模板DNA的PCR反应体系中还比预期多获得了一条扩增片段，本发明以特异 带型作为检出人参的判断标准。也有人RAPD方法对人参进行多样性分析，但是只做到了 RAPD筛选这个环节，却都没有设计出用于人参鉴别的特异性引物。本发明申请人经过多 次的引物设计、验证才获得这一对可以成功鉴别的引物。下面略举数例失败的引物对：

5-CCCGACTCAAAATCGAAG-3(SEQ ID NO.4)

5-TGTCATCCCCTTTGTGTTAA-3(SEQ ID NO.5)

温度梯度55℃、57℃、59℃，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。

5-CCCGACTCAAAATCGAAGT-3(SEQ ID NO.6)

5-AAGCAAGAAGCAAGGGTAACATA-3(SEQ ID NO.7)

温度梯度55℃、57℃、59℃，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。

5-CCCCCGACTCAAAATCGAAGTAA-3(SEQ ID NO.8)

5-GAAGCAAGAAGCAAGGGTAACA-3(SEQ ID NO.9)

温度梯度50℃、52℃、54℃，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。

5-TGTCATCCCCCGACTCAAAAT-3(SEQ ID NO.10)

5-TGTGTTAAATTTTGTATTCGT-3(SEQ ID NO.11)

温度梯度55℃、57℃、59℃，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。

而利用本发明所述的特异性引物，在PCR扩增条件下，所有的人参样本都获得300bp 和130bp的2条特异性SCAR标记片段，而在西洋参、三七、景天三七、栌兰、珠子参、 水田七、姜黄、竹节参、商陆以及所研究的58种其他中药材中则无该特异性带型，均为 阴性扩增。需要说明的是，特异性引物SEQ-2和SEQ-3在人参均可获得特异性扩增，但若 人参经糖炮制后(为习称的红参或白参)，只能在部分样本有效扩增。所有样本总计150 批,其中：人参药材50批(说明R1～R31是人参，R32～R50是经糖炮制过的人参，为习称 的红参或白参)；西洋参14批；三七19批；混伪品9批；其它中药材58批。

总之，本发明通过随机扩增多态性DNA方法筛选人参特异的DNA片段，再经回收， 克隆及测序得到特异序列；根据特异性序列设计特异性引物1和2，将RAPD标记转化为 稳定的SCAR标记，在SCAR标记快速分子检测人参的方法中，可扩增并获得特异带型， 为约300bp、130bp大小的2个DNA片段。但在西洋参、三七、景天三七、栌兰、珠子 参、水田七、姜黄、竹节参、商陆以及所研究的58种其他中药材中则无该特异性带型， 均为阴性扩增。使用此方法鉴别人参的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩 增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。本发明应用特异性SCAR标记PCR检测技术检测 人参，该鉴定方法操作简单、特异性强、样品量少，能快速、准确鉴定人参，为人参鉴 定提供了一种实用的技术，具有实际的应用价值。

附图说明

图1：特异性引物对(引物1和2)扩增人参药材的电泳图，样本R1～R50，空白对照(标为 “-”)。

M：为DNA分子大小标记(Marker)，DNA ladder(50bp)从上至下依次为：500bp、400bp、 350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp。

图2：特异性引物对(引物1和2)扩增西洋参药材的电泳图，样本X1～X14,人参样本编号 R1阳性对照(标为“+”)。

图3：特异性引物对(引物1和2)扩增三七药材的电泳图，样本S1～S19,人参样本编号R1 阳性对照(标为“+”)。

图4：特异性引物对(引物1和2)扩增混伪品药材的电泳图，样本H1～H9，空白对照(标为 “-”)。

图5：特异性引物对(引物1和2)扩增其它中药材的电泳图，样本Z1～Z58，人参样本编号 R1阳性对照(标为“+”)，空白对照(标为“-”)。

图6：采用通用引物ITS2对所有样本扩增的结果，样本编号和上述图1至图5相同。M： 为DNA分子大小标记(Marker)D2000，从上至下依次为：2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp。空白对照(标为“-”)。

具体实施方式

本发明的实验选用的材料：所有样本总计:150批，其中：人参药材50批(说明 R1～R31是人参，R32～R50是经糖炮制过的人参，为习称的红参或白参)；西洋参14批； 三七19批；混伪品9批；其它中药材58批。(材料如表1至表5所示)

本发明首先用RAPD分子标记技术对人参、西洋参、三七共29份样本进行基因组 DNA进行PCR扩增，筛选获得特异性片段，此特异性片段经回收、克隆测序、引物设 计，转化为SCAR标记。

用于鉴定人参的分子标记方法步骤如下：

(1)基因组DNA的提取：用70％乙醇对样本表面擦试消毒，洁净通风处挥干，使 用研磨罐进行样本粉碎，各样本称取粉末30mg置于离心管中,采用原平皓生物技术有限公 司的新型广谱植物组DNA快速提取试剂盒法提取各材料的总DNA。

(2)PCR扩增，反应体系总体积为25μL，其中包括：5×Primer STAR Buffer(Mg²⁺plus)5.0μL，dNTPs mixture(2.5mM)2.5μL，鉴别引物1(10μM)0.75μL，引物2(10μM) 0.75μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara，2.5U/μL)0.25μL，DNA模板1.0μL，无 菌双蒸水补充至25μL。

为了防止污染和误差的产生，建立阳性对照和空白对照，样本阳性对照采用通用引 物ITS2进行扩增，空白对照为灭菌双蒸水代替模板DNA。

ITS2引物序列：ITS2F:5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’(SEQ ID NO.12)；

ITS3R:5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’(SEQ ID NO.13)。

PCR的扩增程序为:95℃预变性3min，98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃延伸7min，4℃保存。

(3)取5μL扩增产物加1μL 6×Loading Buffer混匀，采用1.5％的琼脂糖凝胶，在 100V电压下电泳40分钟，在凝胶成像系统下观察并拍照保存。

结果显示：所有的人参样本都获得300bp和130bp的2条特异性SCAR标记片段， 而在西洋参、三七、景天三七、栌兰、珠子参、水田七、姜黄、竹节参、商陆以及所研 究的58种其他中药材中则无该两条特异性带型，均为阴性扩增。

本发明所有样品来源表

表1 人参样本

表2 西洋参样本

表3 三七样本

表4 混伪品样本

表5 其它中药材