犬α7干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的活性表达及分析

摘要

干扰素(Interferon，IFN)是由特定细胞产生的一类具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的分泌型糖蛋白，是机体防御系统的重要组成部分。近年来，由于干扰素具有无药物残留，无毒副作用的特点，使其在防治畜禽疫病特别是病毒性疫病方面越来越受到关注。但是犬干扰素-α(CaIFN-α)的研究和应用相对落后。
　　 1.为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素，在犬肝脏组织中克隆获得犬α干扰素第7亚型(CaIFN-α7)基因，通过融合PCR的方法在犬α干扰素的N端无缝连接内含肽Ssp DnaB intein(SDI)基因，然后连接入pMAL-c2X载体中，构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的重组表达载体。重组载体在大肠杆菌感受态Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白，经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。重组蛋白在MDCK上对CDV及VSV的抑制活性分别为3.5×105U/mg和3.9×105U/mg。
　　 2.为了使表达的犬α干扰素具有无冗余氨基酸的N端，本研究将犬α干扰素基因连接入pPICZαA载体的分泌信号肽序列后，用LiCl转化法转化入酵母菌GS115中，对培养基上清进行简单处理进行SDS-PAGE分析，表达的蛋白约25ku。分析原因，是由于在犬α干扰素基因序列中有2个潜在的糖基化位点，表达产物被糖基化修饰。酵母表达的犬α干扰素在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分别为9.6×106U/mg和1.1×107U/mg。选择9株重组酵母中表达量最高的9号重组酵母进行发酵罐扩大培养，对发酵培养产物进行SDS-PAGE和抗病毒活性分析，证实其在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分别为2.1×106U/mg和2.6×106U/mg。