高Lys蛋白基因和高Met蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的共表达

摘要

赖氨酸与蛋氨酸均为畜禽的限制性必需氨基酸，其饲料含量直接影响到畜禽蛋白质的合成。本研究旨在通过基因工程手段构建两个表达载体（含高赖氨酸蛋白基因的表达载体和含高蛋氨酸蛋白基因的表达载体），使辣椒花药中高赖氨酸蛋白基因（Cflr）和玉米胚乳中高蛋氨酸基因（zein）在枯草芽孢杆菌中共同表达，建立高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因在微生物中共表达的转基因技术，为将含有高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因的益生菌应用于奶牛生产提供技术基础。
　　 本实验从辣椒花药中提取总RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板，根据高赖氨酸蛋白基因的基因序列和枯草芽孢杆菌表达载体pHT43的多克隆酶切位点设计两对引物，通过PCR扩增出目的基因片段，获得长为720bp的Cflr的DNA片段，与预期的目的片段大小一致。将辣椒花药高赖氨酸蛋白基因(Cflr)片段克隆到pMD18-T载体上，经PCR鉴定出的阳性克隆进行测序，将测序结果与NCBI上报道Cflr的cDNA全序列基因(基因登录号:EU367999)进行同源性比较、分析，结果同源性为99％。
　　 本实验从新鲜的玉米胚乳中提取RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板，根据高蛋氨酸蛋白基因的基因序列和枯草芽孢杆菌表达载体pHT43的多克隆酶切位点设计两对引物，通过PCR扩增出目的基因片段，获得长为476bp的zein的DNA片段，与预期的目的片段大小一致。将玉米醇溶蛋白基因（zein）片段克隆到pMD18-T载体上，经PCR鉴定出的阳性克隆进行测序，将测序结果与NCBI上报道zein的cDNA全序列基因(基因登录号为:541922 dzs10)进行同源性比较、分析，结果同源性为99％。
　　 将测序成功的PCR产物Cflr基因片段通过酶切位点连接到原核表达载体pHT43上，转入大肠杆菌TOP10中，经质粒PCR和XbaⅠ+SmaⅠ双酶切鉴定，筛选阳性重组子，构建成枯草芽孢杆菌原核表达质粒pHT43/Cflr;再将测序成功的PCR产物zein基因片段通过酶切位点连接到原核表达载体pHT43上，转入大肠杆菌TOP10中，经质粒PCR和XbaⅠ+SmaⅠ双酶切鉴定，筛选阳性重组子，构建成枯草芽孢杆菌原核表达质粒pHT43/zein。通过化学转化法首先将原核表达质粒pHT43/Cflr转入野生型枯草芽孢杆菌168中，然后再将原核表达质粒pHT43/zein转入含有质粒pHT43/Cflr的枯草芽孢杆菌中。经过菌液PCR和测序等筛选出阳性重组克隆，构建成含有高Lys蛋白基因和高Met蛋白基因的枯草芽孢杆菌168重组菌。
　　 重组菌经IPTG诱导，分别在mRNA水平和蛋白水平上检测到Cflr和zein基因的表达情况。通过qRT-PCR方法证明Cflr和zein基因在枯草芽孢杆菌中有mRNA水平的表达;通过SDS-PAGE方法可以证明Cflr和zein基因在枯草芽孢杆菌中有蛋白水平的表达，SDS-PAGE中出现两条明显的目的蛋白条带，一条大小为24kD，另一条大小为16kD。经HPLC检测重组菌发酵菌液的赖氨酸含量比野生型菌株菌液提高了16.05％，蛋氨酸含量提高了24.94％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 赖氨酸在畜牧业上的应用

1．1．1 赖氨酸的微生物合成途径

1．1．2 赖氨酸作为饲料添加剂的功效

1．1．3 L-赖氨酸在畜牧业上的应用

1．1．4 高赖氨酸蛋白基因及其在转基因方面的研究进展

1．2 蛋氨酸在畜牧业上的应用

1．2．1 应用

1．2．2 高蛋氨酸蛋白基因的研究进展

1．3 赖氨酸和蛋氨酸共同作用于动物的研究进展

1．4 益生菌在畜牧业上的应用

1．4．1 益生菌定义及分类

1．4．2 益生菌作为饲料添加剂的必备条件

1．4．3 益生菌的作用及应用

1．5 枯草芽孢杆菌概述及其在转基因方面的研究进展

1．5．1 枯草芽孢杆菌的介绍

1．5．2 枯草芽孢杆菌外源基因表达系统

1．5．3 枯草芽孢杆菌在畜牧业上的应用

1．6 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 培养基

2．1．3 实验药品

2．1．4 实验仪器

2．1．5 主要试剂和缓冲溶液

2．1．6 引物设计

2．2 实验方法

2．2．1 原料总RNA的提取及cDNA的形成

2．2．2 PCR扩增产物的转化和序列测定

2．3 枯草芽孢杆菌表达载体的构建及转化

2．3．1 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr的构建

2．3．2 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／zein的构建

2．3．3 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr和pHT43／zein的转化

2．4 高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因在mRNA水平的表达

2．5 高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因的诱导表达

2．6 HPLC检测枯草芽孢杆菌重组发酵茵液中赖氨酸和蛋氨酸的含量

2．7 数据处理

3 结果与分析

3．1 基因的扩增

3．1．1 高赖氨酸蛋白基因C?lr的扩增

3．1．2 高蛋氨酸蛋白基因zein的扩增

3．2 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr和pHT43／zein的构建

3．2．1 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr构建

3．2．2 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／zein的构建

3．3 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr和pHT43／zein的转化

3．3．1 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr的转化

3．3．2 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／zein的转化

3．3．3 重组质粒pHT43／C?lr和pHT43／zein的稳定性

3．4 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr和pHT43／zein在mRNA水平的表达

3．5 枯草芽孢杆菌表达载体pHT43／C?lr和pHT43／zein在蛋白水平的表达

3．6 HPLC检测重组菌发酵液中赖氨酸和蛋氨酸的含量

4 讨论

4．1 RNA的提取

4．2 目的基因的克隆

4．3 表达载体的构建

4．4 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化方法的选择

4．5 IPTG诱导枯草芽孢杆菌中目的基因的表达

4．6 重组菌中Lys和Met含量的测定

4．7 重组的枯草芽孢杆菌应用于奶牛生产中的安全性问题

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文