Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定及实时荧光定量RT-PCR方法的建立

摘要

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种高度致死性传染病。本试验旨在建立一种快速、特异、准确的鉴别诊断Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)方法，为保证诊断的可靠性及对该病的诊断监测提供了重要的试验数据与理论依据。
　　 本研究参考GenBank上登录的Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组序列在5'UTR区域设计合成两对引物DHVF/DHV1AR和DHVF/DHV1CR(共用一条上游引物)，扩增长度分别为214bp与289bp。用这两对引物对Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒进行扩增，获得了与设计大小相符的特异条带，并对该方法的敏感性、特异性进行了检测，结果表明本试验建立的用于Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒鉴别诊断RT-PCR方法具有较高的特异性与敏感性，只能特异的检测出Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒，不能检出番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)和鸭黄病毒(DFV)，最低RNA模板检出量约为41.2pg和65.6pg。因此，所建立的RT-PCR检测技术可用于Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速鉴别诊断。
　　 采取浙江某鸭场发病典型的16日龄鸭及本实验室2010年保存发病鸭的肝脏、脾脏组织，用建立的·RT-PCR方法进行检测，PCR反应扩增获得目的条带，克隆测序后，新采集的病料经测序后分析发现，所克隆序列同DHV-IA的SH-1/CHN株基因有98.2％的同源性，2010年保存的毒株所克隆序列同DHV-IC的C-GY株基因同源性为97.8％。综合以上试验结果，可确定该病原分别为DHV-IA和DHV-IC，并命名为ZJ2011株和SH2010株。
　　 采用同建立RT-PCR检测方法相同的引物DHVF/DHV1 AR和DHVF/DHV1 CR，分别建立快速鉴别Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过ZJ2011株和SH2010株的RT-PCR扩增得到目的基因，并克隆到pMD18-T载体，筛选得到阳性标准质粒样品，优化反应条件，以10倍系列稀释的标准样品绘制标准曲线，DHV-IA其扩增相关系数为0.999，扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰，熔解温度为85.2～85.8℃，它对DHV-IC、MDPV、GPV、DRV和DFV均检测不到荧光信号，且对DHV-IA的最小检出量为29.3病毒基因组拷贝数，表明其特异性与灵敏度好。DHV-IC其扩增相关系数为0.998，熔解温度为81.1-81.9℃，它对DHV-IA、MDPV、GPV、DRV和DFV均检测不到荧光信号，且对DHV-IC的最小检出量为14病毒基因组拷贝数，表明其特异性强、灵敏度高。
　　 结果表明，建立的实时荧光定量RT-PCR能为Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒早期快速诊断及定量分析提供新的方法。与常规RT-PCR相比实时荧光定量RT-PCR灵敏度更高，具备一定的优越性，不但能鉴别DHV-IA与DHV-IC而且可检测病毒的含量。本文所建立的常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法均可满足生产实际的需要，为临床样品的检测提供科学依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 Ⅰ型鸭肝炎病毒的分类地位

1．2 Ⅰ型鸭肝炎病毒的基因组结构特点

1．2．1 全基因组的结构特点

1．2．2 5’UTR与3’UTR的结构特点

1．3 Ⅰ型鸭肝炎病毒的诊断进展

1．3．1 中和试验

1．3．2 琼脂扩散试验

1．3．3 酶联免疫吸附实验

1．3．4 胶体金法

1．3．5 血凝试验

1．3．6 分子生物学诊断技术

1．3．7 荧光抗体检测

1．4 Ⅰ型鸭肝炎病毒的防治

1．5 实时荧光定量PCR简介

1．5．1 实时荧光定量PCR技术原理

1．5．2 实时荧光定量PCR技术的种类

1．6 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 毒株和病料来源

2．1．2 实验动物

2．1．3 载体与菌株

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要仪器

2．1．6 有关培养基和溶液的配制

2．2 Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒一管RT-PCR鉴别诊断方法的建立

2．2．1 引物设计与合成

2．2．2 核酸的提取和PCR反应

2．2．3 目的基因的克隆及序列分析

2．2．4 反应条件优化

2．2．5 特异性试验

2．2．6 灵敏性试验

2．3 浙江株病毒的分离

2．3．1 接种病料处理

2．3．2 病毒增殖及鸭胚接种试验

2．3．3 病毒的鉴定

2．4 Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建业

2．4．1 引物的设计与合成

2．4．2 标准品质粒制备

2．4．3 荧光定量RT-PCR反应体系相关参数的优化

2．4．4 荧光定量RT-PCR扩增与标准曲线的建立

2．4．5 荧光定量RT-PCR特异性试验

2．4．6 荧光定量RT-PCR重复性试验

2．4．7 荧光定量RT-PCR敏感性试验

2．4．8 样品检测及与常规PCR检测方法的比较

3 结果

3．1 Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒一管RT-PCR鉴别断诊方法的建立

3．1．1 RT-PCR反应条件优化的结果

3．1．2 RT-PCR方法的建立及特异性试验结果

3．1．3 敏感性试验结果

3．2 浙江株病毒的分离

3．2．1 病毒增殖试验结果

3．2．2 动物回归试验结果

3．2．3 RT-PCR扩增结果

3．2．4 测序结果

3．3 Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

3．3．1 标准品质粒的浓度

3．3．2 反应体系的优化

3．3．3 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立

3．3．4 特异性检验结果

3．3．5 敏感性试验结果

3．3．6 重复性试验结果

3．3．7 荧光定量FQ-PCR与常规PCR检测样品的比较

4 讨论

4．1 Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒一管RT-PCR鉴别诊断方法的建立

4．2 浙江株病毒的分离

4．3 Ⅰ型与新Ⅰ型鸭肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

4．4 常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的比较

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文