连续春化繁殖导致大白菜冬性减弱的分子机理初探

摘要

大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour) Olsson)起源于我国，是十字花科芸薹属中重要的蔬菜作物之一，大白菜有先期抽薹现象，即抽薹时间发生在其营养体还未充分长成之前，抽薹后因其失去了食用价值而导致经济效益大幅度降低。在我国高海拔地区春夏白菜生产和北方地区春大白菜栽培中，常有先期抽薹现象的发生。
　　 大白菜种子连续春化繁殖过程中存在着后代冬性减弱的现象，有研究报道称植物春化后，甲基化水平降低而易抽薹开花。因此为了在分子水平上揭示大白菜连续春化造成后代冬性减弱的机理，进而指导大白菜良种繁育工作，本试验针对大母株采种以及春化一次、连续春化二次、连续春化三次混合授粉繁育出的大白菜，利用MSAP（甲基化敏感扩增多态性）技术进行基因组DNA甲基化水平的检测。同时采用半定量RT-PCR的方法检测FLC1、FLC2、FCA、SAMS基因在不同处理的大白菜植株上的表达量，并进一步采用荧光定量RT-PCR的方法检测SAMS、FLC1基因的表达。针对FLC1基因表达量的差异，选取表达量差异最大的大母株采种及春化三代植株，对其FLC1基因启动子区域进行BSP（重亚硫酸盐测序法）检测，以分析启动子区域甲基化对FLC1基因表达量的影响。从而在分子水平上明确连续春化导致冬性减弱的机制。本试验取得如下结论:
　　 (1)通过对大母株采种、春化一次、连续春化二次、连续春化三次的A161及A54-1自交系大白菜基因组DNA甲基化分析发现，这两种大白菜品种的基因组DNA甲基化水平均随春化次数增加而有所降低。
　　 (2)半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测A161自交系不同处理植株的SAMS基因，发现SAMS基因的表达量随着连续春化次数的增加而降低，因SAMS是重要的甲基供体SAM的唯一生成路径，因此认为随着连续春化次数的增加甲基化程度下降，这与MSAP检测结果一致。
　　 (3)通过半定量RT-PCR检测A161自交系不同处理植株的FLC1、FLC2、FCA基因的表达量发现，FLC1及FLC2的表达量随着连续春化次数的增加而降低，FCA的表达量随着连续春化次数的增加而升高，这与田间调查的植株冬性随着连续春化次数的增加而减弱相吻合。荧光定量RT-PCR对FLC1基因表达量的进一步检测，也有同样的结果。
　　 (4)通过BSP检测FLC1基因启动子区域的甲基化，发现连续春化三次的A161自交系-293bp处胞嘧啶C发生了去甲基化，此位点FLC1基因启动子区域的甲基化变化可能导致了FLC1基因表达量的变化。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 春化作用研究现状

1．2．2 DNA甲基化研究进展

1．2．3 SAMS基因的研究进展

1．2．4 FLC基因的研究进展

1．2．5 FCA基因的研究进展

1．3 主要研究内容

1．4 本试验技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要分子生物学及生化试剂

2．1．3 主要试验仪器

2．1．4 主要软件

2．2 植物材料的处理、取样及冬性调查

2．3 试验方法

2．3．1 MSAP法检测基因组甲基化

2．3．2 大白菜SAMS基因及开花相关基因的半定量RT-PCR表达分析

2．3．3 SAMS、FLC1基因的实时荧光定量RT-PCR表达分析

2．3．4 特定位点的DNA甲基化水平分析

3 结果与分析

3．1 不同处理的大白菜冬性调查

3．2 MSAP检测基因组甲基化

3．2．1 大白菜基因组DNA的提取

3．2．2 预扩增和选择性扩增产物的琼脂糖电泳检测

3．2．3 不同处理的大白菜基因组甲基化类型

3．2．4 不同处理的大白菜基因组DNA甲基化水平差异

3．2．5 不同处理的大白菜基因组DNA甲基化模式差异

3．3 半定量RT-PCR表达分析

3．3．1 大白菜总RNA的提取

3．3．2 SAMS基因在不同处理植株上的表达量

3．3．3 FLC1基因在不同处理植株上的表达量

3．3．4 FLC2基因在不同处理植株上的表达量

3．3．5 FCA基因在不同处理植株上的表达量

3．4 实时荧光定量RT-PCR表达分析

3．4．1 熔解曲线的建立

3．4．2 不同处理植株上SAMS基因的实时荧光定量RT-PCR表达分析

3．4．3 不同处理植株上FLC1基因的实时荧光定量RT-PCR表达分析

3．5 FLC1基因启动子区域的DNA甲基化

4 讨论

4．1 MSAP检测基因组DNA甲基化

4．2 不同处理的大白菜基因组甲基化水平变化

4．3 不同处理的大白菜抽薹相关基因的表达分析

4．4 半定量RT-PCR与荧光定量RT-PCR

4．5 FLC1基因启动子区域甲基化分析

4．6 本试验的创新点

5 结论

致谢

参考文献

附录

附录A

附录B

攻读学位期间发表的学术论文