CLA对奶牛乳腺上皮细胞TAG合成及相关基因mRNA转录的影响

摘要

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是指一组具有位置和几何异构的十八碳共轭二烯酸的总称。它广泛存在于自然界中，在反刍动物的肉制品和乳制品中含量较多。动物和人体试验已经证实CLA具有诸多生理功能，主要包括抗癌、抗动脉粥样硬化、降低胆固醇、降低体脂、减少脂肪沉积、调节骨组织代谢、强化机体免疫和抗糖尿病。
　　 基于CLA的生理功能，营养学家们努力提高乳中CLA含量，但研究发现，提高乳中CLA含量的同时，却导致奶牛乳脂降低综合症(MFD)。目前研究证实t10，c12-CLA可能是导致奶牛乳脂降低综合症(MFD)的主要原因，因此本试验采用组织块法体外培养奶牛乳腺上皮细胞，探索c9，t11-CLA和t10，c12-CLA纯品对乳腺细胞内乳脂合成及相关基因mRNA转录的影响。在分子水平上，探讨CLA对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯(TAG)含量及脂肪酸合成相关基因mRNA转录的影响。试验结果表明:
　　 (1)采用组织块法实现了体外培养出奶牛乳腺上皮细胞，细胞成活率较高，达到85％以上;经过多次传代和角蛋白18鉴定后，可得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞。测定乳腺上皮细胞的相关生物学性状，试验结果为细胞生长曲线呈“S”型，符合一般细胞生长规律:细胞群体倍增时间为32.18h;细胞接种存活率最高可达87％。
　　 (2)试验结果表明，c9，t11 CLA和t10，c12 CLA均可显著降低乳腺上皮细胞内TAG含量(P＜0.05)，且t10，c12 CLA对TAG的抑制率高于c9，t11 CLA。
　　 (3)气相色谱检测CLA对细胞中脂肪酸组成的影响，结果表明150μmol/L c9，t11 CLA可显著提高细胞内单不饱和脂肪酸(MUFA)的比例（P＜0.05），而50μmol/L c9，t11-CLA显著增加细胞内饱和脂肪酸(SFA)的比例(P＜0.05);细胞内MUFA的比例随着t10，c12 CLA浓度的增加，呈显著下降趋势（P＜0.05）;两种CLA对多不饱和脂肪酸(PUFA)的比例都没有显著影响(P＞0.05)。
　　 (4)外源添加不同浓度的c9，t11-CLA与t10，c12-CLA直接作用于乳腺上皮细胞48 h，采用实时荧光定量PCR技术，测定乳腺上皮细胞脂肪酸摄取与转运及甘油三酯合成相关基因mRNA的转录。试验结果:与对照组相比，50～150μmol/L的c9，t11 CLA和t10，c12 CLA均显著下调LPL基因mRNA的转录水平（P＜0.05）;50μmol/L c9，t11 CLA显著下调CD36基因mRNA的转录水平（P＜0.05），150μmol/L c9，t11 CLA上调它的转录水平（P＜0.05），CD36mRNA的转录水平随t10，c12 CLA浓度增加呈显著上升趋势（P＜0.05）;150μmol/L c9，t11CLA和不同浓度的t10，c12 CLA均可显著上调ACBP基因mRNA的转录水平(P＜0.05);相比对照组，c9，t11 CLA与t10，c12 CLA均显著下调FABP3基因mRNA的转录水平(P＜0.05);150μmol/L的c9，t11 CLA和t10，c12 CLA均可显著上调AGPAT基因mRNA的转录水平(P＜0.05)。
　　 本试验采用组织块法实现了体外培养出奶牛乳腺上皮细胞，细胞接种存活率较高。试验证实CLA抑制乳腺TAG合成且影响乳腺细胞的脂肪酸合成;证明两种CLA均显著降低LPLmRNA和FABP3 mRNA的转录水平，t10，c12 CLA比c9，t11 CLA的降低效果明显。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 CLA的定义与结构

1．2 CLA在食品中的分布

1．3 CLA的生理作用

1．3．1 抗癌作用

1．3．2 抗动脉粥样硬化，降低胆固醇

1．3．3 降低体脂，减少脂肪沉积

1．3．4 促进骨健康

1．3．5 强化机体免疫力

1．4 乳脂CLA的生物合成

1．5 CLA的代谢与整合

1．6 CLA的制备方法

1．7 乳脂降低综合症(MFD)

1．8 CLA对奶牛代谢的影响

1．8．1 CLA对奶牛乳成分的影响

1．8．2 CLA对奶牛乳中脂肪酸组成的影响

1．8．3 CLA对乳中脂肪酸合成相关基因表达的影响

1．9 课题意义

1．10 课题内容

2 材料与方法

2．1 试验材料与试剂

2．1．1 试验材料

2．1．2 试剂

2．2 试验设备

2．3 主要试剂配置

2．4 试验方法

2．4．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养

2．4．2 奶牛乳腺上皮细胞的冻存

2．4．3 奶牛乳腺上皮细胞的复苏

2．4．4 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

2．4．5 奶牛乳腺上皮细胞的生物学性状检测

2．4．6 乳腺上皮细胞处理

2．4．7 乳腺上皮细胞甘油三酯含量的测定

2．4．8 乳腺上皮细胞脂肪酸组成的测定

2．4．9 乳腺细胞内脂肪酸合成相关基因mRNA转录水平的检测

2．4．10 数据分析

3 结果与分析

3．1 乳腺上皮细胞的鉴定

3．2 乳腺上皮细胞的形态学观察

3．3 乳腺上皮细胞的生物学性状检测

3．3．1 细胞生长曲线

3．3．2 细胞群体倍增时间

3．3．3 细胞接种存活率

3．4 CLA对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量的影响

3．4．1 c9，t11-CLA对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量的影响

3．4．2 t10，c12-CLA对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量的影响

3．5 CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸组成的影响

3．5．1 c9，t11-CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸组成的影响

3．5．2 t10，c12-CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸组成的影响

3．6 CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成相关基因mRNA转录的影响

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

4．2 奶牛乳腺上皮细胞的生物学性状检测

4．3 奶牛乳腺上皮细胞培养体系的建立与鉴定

4．4 CLA对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量的影响

4．5 CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸组成的影响

4．6 CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成相关基因mRNA转录的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文