牛化脓隐秘杆菌分离鉴定及毒力因子检测

摘要

化脓隐秘杆菌是经济型家畜、禽以及野生哺乳动物、鸟类黏膜上的一种共生菌，也是造成这些动物感染的一种条件性致病菌，大部分分布在健康动物的乳房、泌尿生殖道、呼吸道和胃肠道黏膜。能导致多种动物多种器官的化脓性感染，造成子宫炎、肾脓肿、奶牛乳房炎、骨髓炎、关节炎等疾病，给养殖业带来严重的经济损失。
　　 本研究从送检病料分离出3株疑似化脓隐秘杆菌分离菌，并对其进行形态特征、培养特性、生化特性鉴定。对三株分离菌进行16SrRNA基因克隆、序列分析。blast结果表明分离菌均为化脓隐秘杆菌。将上述结果与实验室保存的两株化脓隐秘杆菌(HLJ-0912、HLJ-1005)的16SrRNA基因序列比对分析，5株菌16SrRNA序列同源性为99.84％，与国内其他实验室6株化脓性奶牛子宫内膜炎分离株的同源性为99.82％，与5株化脓性肺炎分离株的同源性为99.96％。三株新分离菌分别命名为HLJ-1204-F1、HLJ-1204-F3、HLJ-1204-G3。
　　 对实验室已有5株化脓隐秘杆菌进行毒力因子基因携带情况检测，结果表明HLJ-1005株缺失CbpA，含有NanP、NanH，其余4株含有CbpA、NanH，不含有NanP。根据毒力基因检测结果选取HLJ-1204-F1、HLJ-1204-F3和HLJ-1005株化脓隐秘杆菌以腹腔注射的方式感染小鼠，比较菌株之间毒力差异。设计引物对化脓隐秘杆菌毒力因子（CbpA、NanH、NanP）进行全基因克隆、测序及蛋白结构预测。选取毒力差异明显的HLJ-1204-F1和HLJ-1005株进行毒力因子鉴定。同时制备HLJ-1204-F1、HLJ-1005株全菌体抗血清，并利用制备抗血清，对菌体吸附、侵入MDBK细胞作进一步研究。
　　 动物实验结果显示HLJ-1005株致病力弱于其他两株分离菌。毒力因子全基因测序结果显示NanH基因首尾存在较大突变;CbpA三维结构近似于金黄色葡萄球菌CHA，NanH、NanP符合细菌唾液酸酶模式三维结构。细胞吸附性实验表明化脓隐秘杆菌可吸附于MDBK细胞表面，且HLJ-1204-F1的菌体吸附性要强于HLJ-1005株，同时，制备的全菌体抗血清能够明显的抑制菌体对细胞的吸附，菌体蛋白吸附试验发现4条可吸附于MDBK细胞的菌体蛋白条带，并通过以菌体屏蔽全菌体多抗中抗菌体表面抗体的方法证明具有细胞吸附性质的菌体蛋白位于细菌菌体表面。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 化脓隐秘杆菌研究进展

1．1．1 化脓隐秘杆菌的生物学特性

1．1．2 化脓隐秘杆菌的主要毒力因子及其免疫原性

1．2 化脓隐秘杆菌致病性

1．2．1 化脓隐秘杆菌感染及危害

1．2．2 化脓隐秘杆菌病的诊断

1．2．3 化脓隐秘杆菌病的防治

1．3 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病料及菌株来源

2．1．2 培养基

2．1．3 酶和生化试剂

2．1．4 试验动物

2．1．5 引物

2．1．6 主要溶液配置

2．1．7 主要仪器和设备

2．2 方法

2．2．1 化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

2．2．2 化脓隐秘杆菌的致病力分析

2．2．3 化脓隐秘杆菌主要毒力因子PCR检测

2．2．4 化脓隐秘杆菌cbpA、nanH和nanP基因的克隆及序列分析

2．2．5 兔抗化脓隐秘杆菌高免血清的制备及效价测定

2．2．6 化脓隐秘杆菌抗血清反应性分析

2．2．7 化脓隐秘杆菌细胞粘附性、侵袭性检测

3 结果与分析

3．1 化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

3．1．1 细菌的分离培养

3．1．2 分离菌的生化分析

3．1．3 分离菌16SrRNA基因的扩增及测序

3．2 化脓隐秘杆菌主要毒力因子PCR检测

3．3 化脓隐秘杆菌的致病力分析

3．4 脓隐秘杆菌cbpA、nanH和nanP基因的克隆及蛋白结构分析

3．4．1 化脓隐秘杆菌CbpA结构分析

3．4．2 化脓隐秘杆菌NanH结构分析

3．4．3 化脓隐秘杆菌NanP结构分析

3．5 兔抗化脓隐秘杆菌高免血清的效价测定及血清反应性分析

3．5．1 兔抗化脓隐秘杆菌高免血清琼扩效价的测定

3．5．2 兔抗化脓隐秘杆菌高免血清试管凝集效价的测定

3．5．3 化脓隐秘杆菌CbpA蛋白的血清反应性分析

3．5．4 化脓隐秘杆菌NanH蛋白的血清反应性分析

3．6 化脓隐秘杆菌细胞粘附性、侵袭性检测

3．6．1 化脓隐秘杆菌菌体对MDBK细胞的粘附性检测

3．6．2 化脓隐秘杆菌对MDBK细胞的侵袭性检测

3．8．3 化脓隐秘杆菌菌体裂解蛋白对MDBK细胞的粘附性检测

4．讨论

4．1 化脓隐秘杆菌的分离鉴定

4．2 化脓隐秘杆菌主要毒力因子的检测及蛋白结构预测

4．3 化脓隐秘杆菌致病性分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文