表达猪抗菌肽PF1和PR39重组干酪乳杆菌的构建及其生物学活性测定

摘要

抗菌肽是宿主先天性免疫防御系统中产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽类生物活性物质，能识别和杀灭侵入并定植于动物机体的细菌、真菌，所以在生物体内固有免疫机制过程中它扮演重要角色。
　　 本实验以GeneBank发表的猪抗菌肽PR39和PF1基因为模板，根据乳酸杆菌密码子偏嗜性，通过密码子优化全基因合成了PF1-PR39基因，以其为模板，利用P3、P4引物扩增PR39基因并与表达载体质粒pCold相连接，转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组菌pCold-PR39/BL21(DE3):经IPTG诱导并对其表达条件进行优化，通过SDS-PAGE和Westernblot分析均表明获得表达猪抗菌肽PR39的约51kDa重组蛋白;抑菌试验表明重组抗菌肽PR39对大肠杆菌和沙门氏菌有明显的抑菌作用，抑菌圈直径分别为5.7mm和4.9mm;对金黄色葡萄球菌和干酪乳杆菌没有观察到抑菌作用。
　　 将PR39基因和PF1-PR39基因分别定向插入到乳酸菌分泌表达型载体质粒pPG612的多克隆酶切位点SacⅠ和XhoⅠ之间，构建了细胞分泌表达型重组乳酸菌pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393。用1％的乳糖诱导重组菌，经Western blot鉴定可见目的蛋白得到表达，分别获得约36kDa、30kDa和6kDa的重组蛋白。生长曲线的测定结果表明，与对照菌相比抗菌肽基因的表达并不影响重组菌的生长。以时间动态曲线法测定的体外抑菌试验结果表明重组菌pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393诱导后浓缩上清对金黄色葡萄球菌生长没有抑制作用;而对革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌均可产生明显的抑菌作用;重组菌表达的猪抗菌肽PF1-PR39的抑菌效果要优于PR39。
　　 为检测本研究获得的重组猪抗菌肽是否具有提高动物自身免疫能力的功效，选取SPF级6周龄的BALB/c雌性小鼠，将其随机分成4组，每组9只。实验组分别灌服200μL浓度为109CFU/mL的菌液pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393，对照组分别灌服pPG612/L.casei393和培养基，连续饲喂28d，每周对实验小鼠体重和鼠粮消耗用量进行称重，计算料重比。28d后检测各组实验小鼠外周血淋巴细胞百分率和白细胞数量，在无菌环境下解剖小鼠取空肠和十二指肠的前段约2cm做小鼠肠绒毛扫描电镜切片。称量脾脏重量，计算脾脏指数。采用PCR-DGGE法分析各组实验小鼠饲喂重组菌前后粪便菌群结构的多样性，同时以产肠毒素的大肠埃希氏菌K88+菌株进行攻毒试验，检测重组菌株的保护效果。结果表明通过口服途径饲喂重组菌后，实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393的料重比分别为30.935±0.87和29.702±0.67低于对照组，差异极显著(P＜0.01)其中共表达PF1-PR39组的料重比低于单独表达PR39组，差异显著（P＜0.05）;实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393的淋巴细胞百分率、白细胞数量、脾脏指数与对照组相比均有增加的趋势性且差异显著(P＜0.05)。其中共表达PF1-PR39组的脾脏指数和淋巴细胞比率与PR39单独表达组相比差异不显著，二者的白细胞数相比差异显著（P＜0.05）;小鼠肠绒毛扫描电镜切片可见实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393空肠和十二指肠的绒毛高度和及V/C值与对照组相比均增加，差异极显著(P＜0.01)，而隐窝深度与对照组相比差异不显著，且共表达组的绒毛高度及V/C值明显高于单独表达组，二者比较差异显著(P＜0.05)。从DGGE图谱分析可知，实验组pPG612-PR39/L.casei393和pPG612-PF1-PR39/L.casei393小鼠粪便菌群结构与对照组相比丰富度没有变化，但是微生物多样性指数和均匀度降低。攻毒保护试验结果表明，与对照组相比表达抗菌肽的重组菌株可以明显降低大肠埃希氏菌K88菌株引起的死亡率。
　　 以上结果表明所构建的表达猪抗菌肽PF1-PR39重组干酪乳杆菌表达系统具有潜在的应用前景，重组菌株既具有乳酸菌的益生性，又可以发挥抗菌肽的生物学功能，为以乳酸菌作为传递系统开发新型的动物抗菌肽产品奠定了一定的理论基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 猪源Cathelicidin抗菌肽的研究进展

1．1．1 猪源Cathelicidin抗菌肽的结构特点

1．1．2 猪源抗菌肽PR39和PF1的结构特点

1．2 猪源Cathelicidin抗菌肽的生物学功能

1．2．1 猪源Cathelicidin抗菌肽的抗菌作用及抗菌机理

1．2．2 猪源Cathelicidin抗菌肽的抗肿瘤作用

1．2．3 猪源Cathelicidin抗菌肽的免疫调节作用

1．3 乳酸杆菌表达外源基因的研究进展

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 抗体试剂

2．1．3 质粒与菌种

2．1．4 引物

2．1．5 实验试剂

2．1．6 培养基

2．1．7 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 基因PF1-PR39和PR39的获得

2．2．2 表达PR39基因重组大肠杆菌的构建

2．2．3 PR39基因在大肠杆菌中的诱导表达

2．2．4 重组蛋白抑菌活性检测

2．2．5 PR39基因与PF1-PR39基因重组干酪乳杆菌的构建

2．2．6 重组干酪乳杆菌的诱导表达及鉴定

2．2．7 外源基因PR39和PF1-PR39对重组菌生长曲线的影响

2．2．8 重组干酪乳杆菌体外抑菌实验

2．2．9 口服重组干酪乳杆菌小鼠生理指标的测定

2．2．10 口服重组菌对小鼠外周血淋巴细胞和白细胞数量的影响

2．2．11 口服重组菌对小鼠肠绒毛发育形态的影响

2．2．12 应用PCR-DGGE分析口服重组菌后小鼠粪便菌群结构的多样性

2．2．13 重组干酪乳杆菌对产肠毒素大肠埃希氏菌灌服小鼠保护作用

3 结果

3．1 基因PF1-PR39和PR39的获得

3．2 大肠杆菌重组质粒pCold-PR39的鉴定结果

3．3 PR39基因在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定

3．3．1 表达产物的SDS-PAGE鉴定

3．3．2 Western Blot鉴定PR39重组蛋白

3．4 重组蛋白抑菌活性检测

3．5 PR39基因与PF1-PR39基因重组干酪乳杆菌的构建

3．6 重组干酪乳杆菌的诱导表达及鉴定

3．7 外源基因PR39和PF1-PR39对重组菌生长曲线的影响

3．8 重组干酪乳杆菌体外抑菌实验结果

3．9 口服重组菌对小鼠生长性能的影响

3．10 重组菌对小鼠白细胞数和淋巴细胞比率和脾脏指数的影响

3．11 口服重组菌对小鼠肠绒毛发育形态的影响

3．12 应用PCR-DGGE分析口服样性重组菌后小鼠粪便菌群结构的多样性

3．13 重组菌对产肠毒素大肠埃希菌口服小鼠的保护作用

4 讨论

4．1 PR39与PF1-PR39重组蛋白的表达及其结构分析

4．2 表达PR39与PF1-PR39蛋白重组菌的抑菌作用分析

4．3 表达PR39与PF1-PR39蛋白的重组菌免疫调节作用分析

4．4 表达猪抗菌肽重组干酪乳杆菌的潜在应用

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文