基于假病毒的猪流行性腹泻病毒S1蛋白细胞定位研究

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒属，冠状病毒科，能够导致仔猪严重腹泻，给养猪业带来重大的经济损失。S蛋白作为PEDV最主要的膜蛋白，已有报道证实S蛋白含有病毒感染细胞的抗原表位区，但关于S蛋白介导PEDV进入细胞还有待于进一步研究，故本主要通过构建PEDV S1的伪型病毒研究富含抗原表位区的S1蛋白在PEDV进入细胞中的作用。 本研究中，首先，为有效的检测PEDV，利用Vero E6繁殖的PEDV做为抗原，制备PEDV全病毒多克隆抗体。利用ELISA和间接免疫荧光对抗体的效价和特异性进行检测，结果显示该多克隆抗体与PEDV有很好的特异性反应。 其次，为研究PEDV的感染特性，摒弃非同源细胞系，对PEDV在猪小肠上皮细胞(IEC)上进行适应培养，通过在IEC细胞中盲传10代，对第10代病毒液进行检测。反转录PCR、间接免疫荧光和电镜检查均证实PEDV能够感染IEC细胞系，并稳定传代，故最终确定IEC是PEDV的易感细胞系。 再次，为研究PEDV S1蛋白功能，构建S1蛋白的真核表达质粒，建立稳定表达S1蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-S1。反转录PCR和间接免疫荧光鉴定，成功构建了BHK-S1稳定细胞系。利用BHK-S1稳定细胞系和重组的VSV系统，成功制备PEDV的伪型病毒VSV△G*S1。反转录PCR和激光共聚焦检测结果显示，重组病毒构建成功。 最后，为研究S1蛋白在VSV△G*S1感染IEC细胞中的作用，对感染VSV△G*S1的1EC细胞中的S1蛋白进行动态定位。激光共聚焦结果显示，S1蛋白在病毒感染IEC细胞系的吸附和进入过程中发挥关键作用。本研究为进一步检测PEDV提供了有效实用的实验材料，为研究PEDV的感染特性和探索S1蛋白在PEDV感染细胞时的作用提供了参考。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 PEDV的根源

1．2 PED流行病学

1．3 PEDV基因结构

1．4 PEDV主要结构蛋白功能

1．5 PEDV非结构蛋白功能

1．6 PEDV细胞表面受体研究进展

1．7 PEDV繁殖与装配

1．8 假病毒研究进展

1．9 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 毒株、细胞、工程菌以及质粒

2．1．2 实验动物

2．1．3 实验主要试剂

2．1．4 试剂配制

2．1．5 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 PEDV全病毒多克隆抗体的制备

2，2．2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效价检测

2．2．3 PEDV感染靶细胞猪小肠上皮细胞(IEC)

2．2．4 PEDV S1真核表达载体的构建

2．2．5 PEDV伪型病毒VSV△G*PEDV S1的构建

2．2．6 利用PEDV伪型病毒对被感染IEC细胞中S1蛋白的定位研究

3 实验结果

3．1 PEDV多克隆抗体制备

3．1．1 PEDV繁殖培养

3．1．2 PEDV梯度密度离心

3．2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效价检测

3．2．1 间接ELISA检测

3．2．2 间接免疫荧光检测

3．3 PEDV感染靶细胞IEC

3．3．1 反转录PCR检测

3．3．2 间接免疫荧光检测

3．3．3 电镜检测

3．4 PEDV S1真核表达载体的构建

3．4．1 酶切获取PEDV S1片段

3．4．2 鉴定pcDNA3．1-PEDV S1

3．5 PEDV伪型病毒VSV △ G*PEDV S1的构建

3．5．1 稳定表达S1细胞系的建立

3．5．2 PEDV伪型病毒VSV △ G*S1的鉴定

3．6 利用PEDV伪型病毒对被感染IEC细胞中S1蛋白的定位研究

4 讨论

4．1 PEDV全病毒多克隆抗体的制备

4．2 PEDV感染IEC细胞的研究

4．3 PEDV S1蛋白指导PEDV伪型病毒进入细胞

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文