传染性胰腺坏死病毒VP2--VP3虹鳟肠道乳杆菌表达系统的免疫学评价

摘要

传染性胰腺坏死病毒(Infectious Pancreas Necrosis Virus，IPNV)是引起鲑鳟鱼类传染性胰腺坏死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)的病原体。该病具有高度的接触性和传染性，IPN病毒主要危害鲑鳟鱼的幼鱼，死亡率高达90％以上，幸存的鱼终生带毒，是潜在的感染源。本病的主要病症是肝胰脏等实质器官出血、坏死。该病流行范围广、发病率高、死亡率高，每年给世界各地的渔业养殖带来巨大的经济损失，成为鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。 本研究利用乳酸杆菌选择性培养基MRS从健康的虹鳟肠道内分离乳酸杆菌，经革兰氏染色镜检，选择其中革兰氏阳性、不运动、无芽孢、杆状细菌做过氧化氢酶，氧化酶和硝酸盐还原活性实验均为阴性者进一步纯化。分离到的菌株用糖发酵反应管做基于生化反应的表型鉴定，鉴定结果与《伯杰名细菌分类手册》做比照后归类。为了进一步确认菌株的归类，设计了乳酸杆菌属16s rRNA特异性引物，扩增分离株的16s rRNA序列。测序结果表明，分离株均与植物乳杆菌序列同源性高度一致。虽然有许多学者报道分离出植物乳杆菌，但从虹鳟鱼肠道内分离出植物乳杆菌尚属首次报道。 能否耐受一系列的环境压力，是一株菌能否被用作益生菌的重要参考指标。本实验中测试了筛选出的5株植物乳杆菌对pH、渗透压、胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶及温度的耐受性。5株菌在pH3.0，8％NaCl，0.5％胆盐，7g l-1胰蛋白酶以及10 g l-1胃蛋白酶的条件下均能存活，但是在pH2.0时，5株菌均不能存活。温度耐受性试验表明，5株菌在60℃处理10min可以正常生长，但是在80℃或100℃时均不能存活。通过压力耐受试验，表明本实验从虹鳟肠道内分离筛选出的5株植物乳杆菌进入虹鳟鱼体内后，能够顺利通过胃肠道环境后存活下来。采用打孔法进行5植物乳杆菌对9株病原茵的抑菌活性，5株菌均能够抑制革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria）、停乳链球菌（Streptococcusdysgalactiae）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）以及革兰氏阴性细菌大肠杆菌（Colibacillus）、巴氏杆菌（Pasteurella）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的生长。 乳酸菌可以作为一种很好的抗生素替代品来防治动物疾病的发生。用微生物药敏纸片(6mm)测试5株乳杆菌对8大类24种抗生素的药物敏感性，各菌株都表现出广谱抗生素耐药性。对链霉素(streptomycin)、庆大霉素（Gentamicin）、新霉素(Neomycin)、替考拉宁(Teicoplanin)、卡那霉素（Kanamycin）、氨苄青霉素(Ampicillin)、万古霉素(Vancomycin)和苯唑西林(oxacillin)敏感。所有试验菌株对万古霉素不敏感，对红霉素表现高度敏感，这与之前许多学者对植物乳杆菌的药敏性报道一致。 本研究将虹鳟肠道分离的植物乳杆菌L1026、L1212及对照植物乳杆菌KLDS1.0344经荧光分子探针cFDA-SE标记后，灌喂虹鳟幼鱼。灌喂后1、2、4、6、10、15d，每组每次随机选取3尾虹鳟。解剖获得肠道粘膜冲洗液，用流式细胞仪检测有cFDA-SE荧光标记的细菌的残留率。1-4d，所有组残留的荧光标记菌数量均呈现下降;第6d，分离株L1026的荧光标记菌数显示上升，第10d下降，第15d又升高;分离株L1212在口胃插管后从6到第15d的荧光标记菌数持续上升;而对照组饲喂植物乳杆菌KLDS1.0344的荧光标记菌数6-15d显示持续下降。表明来自虹鳟鱼肠道内的植物乳杆菌能够更好的在虹鳟体内定植，且植物乳杆菌L1212有更强的定植能力。 本研究将本实验室构建的pPG2-VP2-VP3质粒转化于虹鳟肠道分离的植物乳杆菌L1212中，经1％的乳糖诱导，经Western-blotting分析，以兔抗IPNV高免血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，DAB显色液显色后，在NC膜上看到明显的目的条带（约66 KD）。使用海藻酸钠混合菌悬液之后包被颗粒饵料，检测添加和未添加海藻酸钠包被饲料后，菌体存活率，结果表明添加海藻酸钠的组菌落存活数较未添加组高;在饵料中添加1％、2.5％、5％的海藻酸钠，结果显示添加2.5％的海藻酸钠组乳杆菌成活率最高(2.6×106);此外，将添加了海藻酸钠的菌悬液与颗粒饵料混合拌匀，分别置于20℃、32℃、37℃烘干，通过平板菌落计数，显示20℃烘干时菌落存活数最多(2.8×107)。将虹鳟幼鱼分为7组，投喂包被好pPG-2-VP2-VP3/L1212的饵料，同时设立饲喂宿主菌L1212、PBS以及模式菌株pPG612-VP2+3/L393对照组。于免疫第0d、31d、50d、63d采集虹鳟血清，检测血清特异性抗体IgM的变化;结果表明，饲喂重组菌的组均在免疫后第31d就出现了血清抗体。同时设立了间隔免疫组和连续免疫组，结果表明间隔免疫产生的抗体水平稍高于连续免疫组，组间差异不显著(p＞0.05);探讨免疫次数的结果表明，加强免疫后，抗体水平逐渐升高，第66d时达到最高，与对照组相比差异极显著(p＜0.01)，与免疫一次的组比组内差异显著(p＜0.05);用IPNV（sp株）对虹鳟幼鱼进行攻毒，结果显示:采用包被颗粒饵料的方法所制备的传染性胰腺坏死病毒VP2-VP3重组亚单位口服疫苗，在抵抗IPNV感染的过程中，产生了一定的保护作用。 综合以上结果表明，本研究采用包被颗粒饵料的方法制备的重组pPG-2-VP2-VP3植物乳杆菌口服疫苗，对抵抗IPNV的感染有一定的保护作用，可以作为预防IPN的鱼用新型口服疫苗。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 IPN的流行病学

1．2 IPNV的病原学特征及其研究进展

1．2．1 IPNV的分类地位与形态特征

1．2．2 IPNV的理化特性及培养特性

1．2．2 IPNV的结构蛋白及其主要特性功能

1．3 IPNV疫苗研究现状

1．3．1 鱼用疫苗研究进展

1．3．2 IPNV疫苗研究进展

1．4 乳酸杆菌表达外源抗原的研究

1．4．1 乳酸杆菌在水产养殖中的研究

1．4．2 乳酸杆菌作为活载体的应用

1．5 研究的目的意义

2 材料方法

2．1 材料

2．1．1 菌种、质粒、细胞及病毒

2．1．2 实验动物

2．1．3 引物

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要实验仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 虹鳟鱼肠道乳酸菌分离鉴定

2．2．2 虹鳟鱼源植物乳杆菌生理特性试验

2．2．3 定植实验

2．2．4 IPNV VP2-VP3基因在重组虹鳟肠道植物乳杆菌中的诱导表达及鉴定

2．2．5 重组菌包被颗粒饵料

2．2．6 重组菌免疫程序制定及免疫效果评价

3 结果

3．1 虹鳟肠道乳酸菌分离结果

3．2 虹鳟肠道乳酸菌鉴定结果

3．2．1 生化反应鉴定结果

3．2．2 16s rRNA序列分析结果

3．3 虹鳟鱼源植物乳杆菌生理特性试验

3．3．1 生长曲线测定

3．3．2 压力耐受性实验

3．3．3 抑菌实验结果

3．3．4 药物敏感性实验结果

3．4 定植试验结果

3．4．1 分离株经荧光探针cFDA-SE标记结果

3．4．2 分离株虹鳟体内定植力结果

3．5 VP2-VP3重组虹鳟植物乳杆菌的鉴定

3．5．1 VP2-VP3重组干酪乳杆菌阳性质粒的鉴定结果

3．5．2 VP2-VP3重组虹鳟植物乳杆菌的鉴定结果

3．6 VP2-VP3重组虹鳟植物乳杆菌诱导表达鉴定

3．7 重组鱼源植物乳杆菌饵料包被结果

3．7．1 包被方法摸索结果

3．7．2 包被条件优化

3．8 重组虹鳟植物乳杆菌免疫效果评价

3．8．1 血清特异性抗体IgM的测定

3．8．2 IPNV(sp株)的繁殖

3．8．3 攻毒保护性试验结果

4 讨论

4．1 虹鳟肠道乳杆菌的分离鉴定

4．2 虹鳟鱼源植物乳杆菌生理特性

4．3 体内定植试验

4．4 VP2-VP3重组虹鳟植物乳杆菌的诱导表达

4．5 颗粒饵料的包被

4．6 重组菌免疫效果评价

4．6．1 血清特异性抗体IgM的测定

4．6．2 攻毒保护性试验

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文