猪源多重耐药大肠杆菌转座子的流行及其接合共转移分析

摘要

大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一，也是条件性致病菌和体内共生菌，其流行给畜牧业的发展造成了严重的危害。如今大肠杆菌的耐药性已呈现出越来越严重的趋势，尤其是多重耐药现象更是引起了人们的担忧。转座子是一种比质粒更小的，可自主复制并以低频率移动的DNA片段，由于其可以在细菌染色体、质粒和噬菌体之间移动，使得位于转座子上的耐药性更易于水平传递和散播。因此研究转座子在大肠杆菌的耐药性，特别是在大肠杆菌多重耐药性产生与传播的作用具有重要的临床意义和流行病学价值。本研究通过以下试验了解哈尔滨周边规模化猪场大肠杆菌的耐药性与不同转座子的共存在情况，分析转座子与多重耐药性共转移的关系，可以为有效防治猪源大肠杆菌病、控制大肠杆菌的耐药性传播提供科学依据。 1.在哈尔滨周边规模化发病猪场成功分离了55株大肠杆菌的基础上，采用CLSI(2007)推荐的纸片扩散法检测了55株大肠杆菌对12种兽医临床常用抗菌药物的敏感性。试验结果表明:55株猪源大肠杆菌都表现出不同程度的耐药现象，耐药现象比较严重，其中受试大肠杆菌对复方新诺明、链霉素的耐药率较高，达到80％以上，对阿莫西林-克拉维酸钾、庆大霉素、多西环素、氯霉素、环丙沙星、恩诺沙星的耐药率在50％-80％，对头孢噻呋钠、阿米卡星、氟苯尼考的耐药率低于50％，对多粘菌素B的耐药率为0。同时此次检测的菌株均为多重耐药大肠杆菌，主要表现为3-11耐，多重耐药现象严重。 2.应用PCR方法检测55株多重耐药大肠杆菌中ISEcp1、IS26、tnpA、tnp513与tnpU等5种转座子基因的流行情况，成功扩增到ISEcp1、IS26、tnpA和tnp513四种转座子，检出率分别27.2％、90.9％、50.9％与41.8％，而未扩增到tnpU转座子。此次检测的55株多重耐药大肠杆菌中均检出转座子基因，最少者检出1种转座子，最多者检出4种转座子。 3.采用质粒接合试验分析了55株多重耐药大肠杆菌的耐药性及转座子的可移动性，研究结果表明:55株多重耐药大肠杆菌中有44株链霉素耐药大肠杆菌，其中有25株接合成功，接合率为56.81％(25/44)。25株接合子菌株对链霉素100％耐药，对复方新诺明耐药率为72％、对阿莫西林-克拉维酸钾、环丙沙星及恩诺沙星的耐药率均达到60％以上，对头孢噻呋钠、多西环素及氯霉素耐药率在10-20％，对阿米卡星、氟苯尼考及多粘菌素B的耐药率为0。接合子菌株多重耐药率为92％(23/25)，表现为2-8重耐药。接合子菌株ISEcp1、IS26、tnpA和tnp513的检出率为16％、60％、20％和32％。在此次检测的25株接合子菌株中，最少者无转座子检出，最多者检出3种转座子。 4.接合子菌株与其亲本菌株的耐药性及转座子携带情况对比显示，接合子菌株对12种抗菌药物的耐药率及转座子的检出率均小于或等于其亲本菌株。有5株接合子菌株(H1、H5、S5、A2、A9)的耐药表型与其亲本完全相同，9株接合子菌株(H1、H2、H5、S2、S5、S15、S16、A2、A7)的转座子类型与其亲本完全相同，其中4株接合子菌株(H1、H5、S5、A2)的耐药表型及转座子基因其相应的亲本菌株完全相同，即这些菌株的耐药表型与转座子基因发生了共转移。 5.本试验建立了ISEcp1、IS26、tnpA和tnp513共4种转座子基因的实时荧光定量PCR检测方法，并比较接合子菌株及其亲本菌株中ISEcp1、IS26、tnpA和tnp513共4种转座子基因的绝对拷贝数多少，结果显示亲本菌株转座子基因的绝对拷贝数均大于其接合子菌株的转座子基因拷贝数。 本试验成功筛选出了55株猪源多重耐药大肠杆菌，通过药敏试验及PCR技术分析了这些大肠杆菌的耐药率及转座子的检出率，通过接合试验分析了转座子及多重耐药性通过接合进行水平传播的的共转移性。研究结果为多重耐药大肠杆菌有效防治及控制细菌耐药性的水平传播提供了理论参考，为有效防治猪源大肠杆菌病、控制大肠杆菌的耐药性传播提供科学依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大肠杆菌概述

1．1．1 大肠杆菌的特征

1．1．2 猪源大肠杆菌病

1．1．3 大肠杆菌的耐药现状

1．2 大肠杆菌耐药性的产生机制

1．2．1 遗传机制

1．2．2 生化机制

1．3 转座子的研究进展

1．3．1 转座子的发现

1．3．2 转座子的分类

1．3．3 转座机制

1．3．4 转座子的功能

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 试剂

2．1．3 主要试剂的配制

2．1．4 主要仪器与设备

2．2 方法

2．2．1 大肠杆菌的分离

2．2．2 大肠杆菌的鉴定

2．2．3 药物敏感性试验

2．2．4 耐药大肠杆菌中转座子基因的PCR检测

2．2．5 质粒接合试验

2．2．6 转座子基因的荧光定量检测

3 结果

3．1 大肠杆菌的分离鉴定结果

3．1．1 大肠杆菌的分离情况

3．1．2 大肠杆菌的生化鉴定

3．2 药敏试验结果

3．3 转座子基因的PCR检测结果

3．4 质粒接合试验结果

3．4．1 接合子菌株的药物敏感性试验结果

3．4．2 接合子菌株转座子基因的检测结果

3．4．3 接合子菌株与亲本菌株的比较结果

3．5 转座子基因荧光定量检测方法的建立

3．5．1 重组标准品质粒的鉴定

3．5．2 大肠杆菌转座子基因标准曲线的建立

3．5．3 接合子菌株与亲本菌株的转座子基因荧光定量检测结果

4 讨论

4．1 大肠杆菌的耐药性分析

4．2 大肠杆菌转座子分析

4．3 质粒接合试验分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文