叶色草蛉热休克蛋白基因HSP70的克隆及表达分析

摘要

热休克蛋白HSPs是一类应激蛋白，是生物遇到不利的环境（如热胁迫、药物刺激等）自发产生的一种防御机制，能增强细胞对外界刺激的耐受能力和恢复能力，充当分子伴侣。其中热休克蛋白HSP70在这一家族中最为保守（核酸与氨基酸序列均高度保守）。在生物体内监测热休克蛋白HSP70的表达量的变化，可以作为一种生物指标来对环境污染进行评价。如今田间化学农药使用量很多，对害虫防治的同时应该对天敌昆虫也有影响，因此HSP70成为天敌昆虫对田间应激刺激的一种抵抗指标。在天敌昆虫饲养或者大量释放防治害虫方面，可以通过转基因等技术使天敌昆虫热休克蛋白的表达量升高，从而增强天敌昆虫对外界不利环境的防御能力，使其能够抵御强烈的应激条件，从而成功地防治害虫的同时保全天敌昆虫，这也是从基因角度对天敌昆虫的保护。目前国内外虽然已经报道过一些天敌昆虫的热休克蛋白基因序列，但对于豆科植物主要天敌昆虫叶色草蛉的HSP70的基因序列尚未见过报道。本实验通过克隆得到HSP70基因，并通过热休克和常用大豆田农药处理测得HSP70表达量的变化分析HSP70对叶色草蛉应激环境下的保护作用。 叶色草蛉(Chrysopa phyllochroma Wesmael)属脉翅目(Neuroptera)，草蛉科(Chrysopidae)。主要取食大豆蚜、茄无网长管蚜、豆蓟马等重要田间害虫，对叶色草蛉分子生物学的研究尚未有报道。 (1)基因克隆:本文研究克隆了叶色草蛉Hsp70 eDNA全长序列:该序列含有2178个碱基包括一个1944个碱基的开放阅读框，编码一个含648个氨基酸残基的蛋白，分子量约为70.92kDa，等电点pI为5.27，已经登录GenBank并获得登录号(KF311064)。克隆了叶色草蛉Hsc70 cDNA全长序列:该序列含有2466个碱基，包括一个1956个碱基的开放阅读框，编码一个含652个氨基酸残基的蛋白，分子量约为71.5kDa，等电点pI为5.54，已经登录GenBank并获得登录号(KJ599671)。 (2)原核表达:Western blot分析结果表明，重组质粒pET/Hsp70与pET/Hsc70的原核表达结果与预期结果相符，确为叶色草蛉Hsp70/Hsc70基因的表达。 (3)不同温度的表达:利用Real Time PCR技术，对不同温度胁迫下的叶色草蛉各龄期Hsp70与Hsc70表达水平进行的相对定量分析表明:叶色草蛉1龄、2龄幼虫和成虫在4-33℃范围内Hsp70表达量随温度升高而显著增高，33℃达到最高，33-43℃范围内Hsp70表达量下降。以24℃为对照，1龄幼虫33℃的Hsp70是24℃表达量的2.1倍，2龄幼虫为2.4倍，成虫为3.0倍。3龄幼虫和蛹在4-37℃范围内Hsp70表达量随温度升高而显著增高，37℃达到最高，37-43℃范围内Hsp70表达量下降，以24℃为对照，3龄幼虫37℃的Hsp70是24℃表达量的10.3倍，蛹为1.4倍。而各龄期Hsc70的表达量变化不明显，均在2倍左右。通过不同温度下叶色草蛉Hsp70的表达量变化分析可知，在33-37℃范围叶色草蛉各龄期Hsp70表达量升高，因此叶色草蛉对这个温度范围最敏感，其中3龄幼虫敏感度最高，其次为成虫。而Hsc70的表达量并无明显变化。由此可知Hsp70在昆虫受到热休克胁迫下起着重要作用。 (4)不同药剂处理的表达:在药剂处理中，使用了常用的两种除草剂精喹禾灵+咪草烟混剂、氟磺胺草醚，和两种常用杀虫剂氧乐果、氯氟·丙溴磷，以蒸馏水为对照。 首先检测不同药剂对不同龄期的影响:精喹禾灵+咪草烟混合剂处理，叶色草蛉1龄、2龄、3龄和蛹的Hsp70表达量较高。叶色草蛉1龄幼虫喷洒精喹禾灵+咪草烟混合剂是对照Hsp70表达量的1.3倍，2龄幼虫为4.4倍，3龄幼虫为8.4倍，蛹为3.2倍。叶色草蛉成虫对氯氟·丙溴磷更敏感，是对照Hsp70表达量的7.6倍。而四种药剂处理下，不同龄期Hsc70的表达量变化不明显。 其次检测同一药剂对不同龄期的影响:对精喹禾灵+咪草烟较敏感的龄期顺序为3龄，2龄，蛹，1龄和成虫;氟磺胺草醚烟较敏感的龄期顺序为3龄，2龄，成虫，1龄和蛹;氧乐果较敏感的龄期顺序为成虫，2龄，3龄，1龄和蛹;氯氟·丙溴磷较敏感的龄期顺序为成虫，3龄，2龄，1龄和蛹。以上顺序是按照Hsp70的表达量变化分析得到的，Hsc70的表达量变化不明显。通过分析四种药剂对不同龄期的影响可知除草剂对叶色草蛉2龄和3龄幼虫影响较大，杀虫剂对成虫和3龄幼虫影响较大。因此，田间应用这些药剂的时候最好避开叶色草蛉敏感龄期盛发期，以避免杀伤叶色草蛉。 温度和药剂处理对叶色草蛉HSP70的表达量的研究，进一步表明Hsp70是存在于机体的一种应激蛋白，在应激条件下能够被高度诱导;Hsc70是一种组成型蛋白，外界环境刺激对其表达量影响不大。因此，HSP70对叶色草蛉抵抗热休克和农药刺激起着重要的作用，不仅可以根据田间温度情况释放叶色草蛉，也可以避开叶色草蛉对除草剂和杀虫剂的敏感时期喷施农药。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 热休克蛋白

1．1．1 热休克蛋白的研究史

1．1．2 热休克蛋白的分类

1．1．3 热休克蛋白的生物学特性

1．1．4 热休克蛋白主要的生物学功能

1．2 热休克蛋白HSP70

1．2．1 热休克蛋白HSP70的结构

1．2．2 热休克蛋白HSP70的生物学功能

1．2．3 Hsp70与Hsc70的联系与区别

1．3 昆虫热休克蛋白的研究概况

1．3．1 HSP70与昆虫耐热性

1．3．2 昆虫滞育与热休克蛋白

1．3．3 HSP70在昆虫生物学方面的研究

1．3．4 昆虫HSP70的医学意义

1．3．5 昆虫HSP70在环境污染监测中的应用

1．4 研究目的及意义

1．5 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 昆虫来源

2．1．2 试验仪器及试剂

2．1．3 分子生物学用的酶和试剂盒以及各种试剂和培养基

2．1．4 生物信息学相关网站及软件

2．2 试验方法

2．2．1 叶色草蛉RNA提取

2．2．2 利用RT-PCR扩增保守区之间的cDNA序列

2．2．3 RACE引物的设计

2．2．4 3’-RACE和5’-RACE的试验步骤

2．2．5 全长cDNA的获取

2．3 序列分析

2．4 蛋白质分析及功能预测

2．5 目标基因在原核载体中的表达

2．5．1 ORF扩增

2．5．2 酶切反应

2．5．3 大肠杆菌表达载体的构建与表达

2．6 表达蛋白的Western blot分析

2．7 叶色草蛉Hsp70与Hsc70 mRNA表达水平研究

2．7．1 叶色草蛉基因的提取

2．7．2 荧光定量PCR引物的设计

2．7．3 荧光定量PCR的反应与结果分析

3 结果与分析

3．1 叶色草蛉Hsp70／Hsc70的基因保守区片段

3．2 叶色草蛉Hsp70／Hsc70基因cDNA序列的3’RACE

3．3 叶色草蛉Hsp70／Hsc70基因cDNA序列的5’RACE

3．4 Hsp70／Hsc70基因cDNA全长序列

3．5 HSP70基因序列分析

3．5．1 叶色草蛉Hsp70基因序列分析

3．5．2 叶色草蛉Hsc70基因序列分析

3．6 Hsp70的基因特征分析

3．6．1 氨基酸序列组成分析

3．6．2 信号肽分析

3．6．3 氨基酸糖基化位点预测

3．6．4 预测蛋白的疏水性分析

3．6．5 空间结构预测

3．7 HSP70蛋白氨基酸序列同源性分析

3．7．1 叶色草蛉Hsp70氨基酸序列同源性比较

3．7．2 叶色草蛉Hsc70基因氨基酸序列同源性比较

3．8 叶色草蛉HSP70基因氨基酸的系统发育分析

3．8．1 叶色草蛉Hsp70基因氨基酸序列一致性分析

3．8．2 叶色草蛉Hsc70基因氨基酸序列一致性分析

3．9 叶色草蛉Hsp70基因的原核表达

3．9．1 重组质粒的构建与鉴定

3．9．2 叶色草蛉Hsp70诱导表达及Western blot验证

3．10 Hsp70与Hsc70表达水平研究

3．10．1 不同温度处理对叶色草蛉Hsp70／Hsc70表达分析

3．10．2 不同农药处理对叶色草蛉Hsp70／Hsc70表达分析

3．10．3 四种农药对叶色草蛉不同龄期的Hsp70／Hsc70表达分析

4 讨论

4．1 实验方法

4．2 温度和农药对叶色草蛉HSP70s表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文