乳杆菌对Staphylococcus aureus和Streptococcus pyogenes抑菌作用的研究

摘要

细菌是皮肤表面最常见的微生物，细菌性皮肤感染也是最常见的皮肤感染疾病，细菌性皮肤感染常见的致病菌是金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌。细菌性皮肤感染通常表现为斑（片）、丘疹、丘疱疹、水疱、囊肿等原发性损伤，也可表现为脱屑、糜烂、溃疡等继发性损伤。目前，治疗细菌性皮肤感染主要采用抗生素药物。一些常用的抗生素类药物有复方新诺明、四环素、利福平、氟喹诺酮等。但是，抗生素类药物的大量使用，容易使致病菌产生抗药性，引发更为严重的感染，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所引发的社区获得性皮肤感染就是一个很好的例子。另外，大量使用抗生素类药物可能会引发其他种类致病菌的变异，对人体健康造成严重的不利影响。因此，找到一种对人体危害小甚至零危害的治疗方法，将会对皮肤感染的治疗具有十分重要的意义。 本研究的目的是分析乳杆菌代谢产物对细菌性皮肤感染主要致病菌（金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌）的抑制作用，分析乳杆菌用于治疗细菌性皮肤感染的可行性。首先，筛选对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌抑菌效果强的乳杆菌，采用的是基于双层平板打孔法的抑菌试验。然后，检测分析乳杆菌代谢产物中主要的抑菌物质。包括以下四部分的试验:经过不同处理的乳杆菌发酵上清液的抑菌试验;H+浓度对抑菌作用影响试验;基于双层平板打孔法、高效液相色谱法(HPLC)和比色法，乳杆菌培养过程中发酵上清液的抑菌活性、有机酸含量和H2O2含量的检测试验;乳酸、乙酸和H2O2对的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定试验。最后，检测分析抑菌效果强的四株乳杆菌用于商业化生产的可行性。包括以下三部分试验:乳杆菌所在属种的鉴定试验;与用于治疗细菌性皮肤感染的部分商品的对比试验;乳杆菌的安全性评价试验。 研究结果表明，乳杆菌在对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的抑菌试验中均有抑菌圈出现，不同菌株所产生的抑菌圈直径大小差别较大，乳杆菌发酵上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌试验产生的抑菌圈大于化脓性链球菌。 乳杆菌的发酵上清液经不同处理后的抑菌试验中，除H2O2后抑菌圈直径都减小;除有机酸后检测不到明显的抑菌圈;除H2O2、除有机酸再浓缩10倍后可以检测到直径很小的明显抑菌圈。无菌MRS（调pH分别为3.5、4.0、4.5）的抑菌试验中，pH为4.0、4.5的MRS液体培养基没有检测到抑菌圈;而pH为3.5的MRS液体培养基在对化脓性链球菌的抑菌试验中仅检测到了较小的抑菌圈(8.46 mm)。 乳杆菌培养过程中，抑菌活性大小:KLDS1.0667＞KLDS1.0391＞KLDS1.0342-1＞KLDS1.0344＞KLDS1.0203＞KLDS1.0210-1，乳酸含量大小:KLDS1.0391＞KLDS1.0667＞KLDS1.0342-1＞KLDS1.0344＞KLDS1.0203＞KLDS1.0210-1，乙酸含量大小:KLDS1.0667＞KLDS1.0391＞KLDS1.0342-1＞KLDS1.0344＞KLDS1.0203＞KLDS1.0210-1，H2O2含量大小:KLDS1.0203＞KLDS1.0667＞KLDS1.0391＞KLDS1.0344＞KLDS1.0210-1＞KLDS1.0342-1。对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的MIC:H2O2＜乙酸＜乳酸，对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的MBC:H2O2＜乙酸＜乳酸。 KLDS1.0344、KLDS1.0667、KLDS1.0391为植物乳杆菌，KLDS1.0342-1为副干酪乳杆菌，与实验室菌种库的命名和编号一致。活菌制剂类药物中分离出来的乳杆菌F1培养过程中发酵上清液有机酸含量、H2O2含量和对指示菌的抑菌活性都较低。乳杆菌的安全性评价试验中，KLDS1.0344、KLDS1.0667、KLDS1.0342-1、KLDS1.0391对链霉素均具有抗性，KLDS1.0344对氨苄青霉素和庆大霉素还具有一定的抗性，对四环素、红霉素、氯霉素敏感，KLDS1.0667、KLDS1.0342-1、KLDS1.0391对氨苄青霉素、四环素、红霉素、氯霉素、庆大霉素敏感;化脓性链球菌ATCC19615菌落周围出现透明的溶血圈，KLDS1.0344、KLDS1.0667、KLDS1.0342-1、KLDS1.0391菌落周围没有溶血圈出现。 本研究中，对细菌性皮肤感染主要致病菌抑菌效果最强的乳杆菌为植物乳杆菌KLDS1.0344、KLDS1.0667、KLDS1.0391，副干酪乳杆菌KLDS1.0342-1。乳杆菌代谢产物中最主要的抑菌物质是乳酸，乙酸和H2O2对乳杆菌的抑菌活性也有影响。对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌抑菌和杀菌作用的大小:H2O2＞乙酸＞乳酸。植物乳杆菌KLDS1.0667、KLDS1.0391对细菌性皮肤感染常见致病菌的抑菌效果强，对常见的五种抗生素抗性小，没有溶血性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 细菌性皮肤感染及治疗方法

1．2．2 乳杆菌治疗细菌性皮肤感染的理论依据

1．2．3 乳杆菌治疗细菌性皮肤感染的研究现状

1．3 本研究的目的和意义

1．4 本研究采用的技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液的配制

2．1．5 主要仪器及设备

2．2 试验方法

2．2．1 供试菌株的活化与培养

2．2．2 对指示菌具有抑制作用乳杆菌的初步筛选

2．2．3 乳杆菌代谢产物对指示菌的抑制作用

2．2．4 H+浓度对抑菌作用的影响

2．2．5 乳杆菌在培养过程中抑菌活性、主要有机酸以及H2O2含量的测定

2．2．6 乳酸、乙酸和H2O2最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

2．2．7 菌株鉴定

2．2．8 用于治疗细菌感染的部分商品对指示菌的抑制作用

2．2．9 乳杆菌的安全性评价

3 结果与分析

3．1 对指示菌具有抑制作用的乳杆菌的初步筛选

3．2 乳杆菌代谢产物对指示菌的抑制作用

3．2．1 乳杆菌代谢产物经不同处理后的抑菌作用

3．2．2 上清液中H+浓度对抑菌作用的影响

3．3 乳杆菌在培养过程中抑菌活性、主要有机酸含量及H2O2含量

3．3．1 乳杆菌在培养过程中发酵上清液的抑茵活性

3．3．2 乳杆菌在培养过程中发酵上清液中有机酸含量的测定

3．3．3 乳杆菌在培养过程中发酵上清液中H2O2含量的测定

3．4 乳酸、乙酸和H2O2最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

3．4．1 MIC的测定结果

3．4．2 MBC的测定结果

3．5 菌株的鉴定

3．6 用于治疗细菌感染的部分商品对指示菌的抑制作用

3．6．1 抗生素类药物对指示菌的抑制作用

3．6．2 活菌制剂类药物对指示菌的抑制作用

3．7 乳杆菌的安全性评价

3．7．1 抗生素抗性试验

3．7．2 溶血性试验

4 讨论

4．1 乳杆菌代谢产物中主要抑菌物质的探究

4．2 乳杆菌培养过程中抑菌活性、主要有机酸含量及H2O2含量的测定

4．2．1 抑菌活性的测定

4．2．2 主要有机酸含量的测定

4．2．3 H2O2含量的测定

4．3 乳酸、乙酸和H2O2对指示菌MIC和MBC的测定

4．4 菌株鉴定方法

4．5 用于治疗细菌性皮肤感染的部分商品对指示菌的抑制作用分析

4．6 乳杆菌的安全性评价

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文