乳酸菌发酵黄浆水生产GABA的研究

摘要

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种天然非蛋白质氨基酸，存在于哺乳动物中枢神经系统(CNS)中，属于一种抑制性神经递质。GABA具有抗焦虑、安神、治疗癫痫、抗衰老等功效，因此受到研究人员的关注。 黄浆水作为豆腐制品生产的副产物，产量越来越高，因此，黄浆水的处理问题日益受到关注。黄浆富含丰富的营养物质和无机盐，同时含有一定量的GABA，在此条件下对黄浆水中营养物质组分和发酵条件进行优化来富集高浓度GABA。 本文研究了乳酸菌在黄浆水中富集GABA的条件以及提取GABA的工艺流程，即:高产GABA乳酸菌的筛选→黄浆水中GABA的富集乳酸菌菌体的去除→不同方法对发酵液的脱色处理（活性炭和大孔吸附树脂）→GABA离子交换→GABA结晶→GABA含量的测定，并对各个步骤进了具体研究。主要结论如下: (1)对黄浆水培养基通过组分进行优化，得出Lactobacillus bulgaricus1.0205生产GABA最优培养基条件为:葡萄糖2％、蛋白胨2％、(NH4)2SO41％、KH2PO40.08％。通过对黄浆水优化培养基的初始pH值和谷氨酸钠添加量的研究，确定初始pH值为7.0、谷氨酸钠的添加量为3％。Lactobacillus bulgaricus1.0205的发酵动态研究表明了发酵过程中生物量、蛋白质含量、pH值以及GABA含量的变化情况，进一步说明Lactobacillus bulgaricus1.0205的生长情况及富集GABA的特性，确定最佳发酵时间为40h，此时发酵液中生物量(OD600)为1.63，GABA含量可达6.22g/L。 (2)在壳聚糖为絮凝剂的基础上进行了单因素絮凝试验，发现以壳聚糖用量1％，聚合三氯化铝添加量3.8％，pH值4.7，慢速搅拌时间20min为最终条件，3次平行试验得到的实际平浊度降低比98.27％，而此时GABA损失率仅为3％左右。 (3)在采用活性炭-超声波联合处理时，色素去除率较高，GABA损失量也略有增加。采用了正交实验，表明活性炭用量5％，超声时间50min，超声功率120W，活性炭颗粒大小50目，脱色率为78.68％，GABA损失率为36.87％。 (4)对5种大孔吸附树脂进行了筛选，发现D101大孔吸附树脂的脱色率和GABA得率均相对较高。D101大孔吸附树脂的静态吸附试验，确定了树脂用量1.5g/20mL，发酵液pH值5，温度20-30℃。通过动态吸附试验考察了发酵液流出速度对D101大孔吸附树树脂脱色效果的影响，结果表明，D101大孔吸附树脂处理发酵液的最佳流速3BV/h，处理量5BV，此时脱色率可达93.2％，GABA得率为86％。洗脱剂对树脂的再次利用具有很大影响，试验表明乙醇浓度80％，pH值7，洗脱速度5BV/h时，色素解析率达可以到93％以上。 (5)对5种离子交换树脂进行了筛选，发现D001离子交换树脂具有对GABA交换容量大优点。D001离子树脂的静态离子交换试验表明，在进行离子交换试验时，发酵液的pH值呈下降趋势，在pH值6时，交换量可达到144.7mg/g，离子交换时间80min，温度为室温。动态离子交换试验表明，2BV/h上样体积流量进行上样，上样量为4.5BV。采用氨水为洗脱液对D001离子交换树脂上的GABA进行洗脱，表明氨水浓度2mol/L，洗脱液的收集量2BV。 (6)采用结晶方法得到GABA产品，GABA收率为48.9％左右，通过高效液相色谱进行纯度的鉴定，产品纯度达到95％以上。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 GABA简介

1．2 GABA的生理功能

1．2．1 抗焦虑、安神

1．2．2 治疗癫痫

1．2．3 抗衰老

1．2．4 GABA的其它生理功能

1．3 GABA的制备与富集

1．3．1 化学法

1．3．2 植物富集法

1．3．3 微生物法

1．4 发酵液中菌体的分离

1．4．1 离心法

1．4．2 絮凝法

1．4．3 其它菌体分离方法

1．5 发酵液中色素的去除

1．5．1 离子交换纤维法

1．5．2 吸附法

1．6 GABA的分离提取

1．6．1 膜分离法

1．6．2 离子交换法

1．6．3 结晶法

1．7 GABA的富集与提取的国内外研究现状

1．7．1 国内研究现状

1．7．2 国外研究现状

1．8 研究目的与意义

1．9 本课题的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验原料

2．1．2 试验菌株

2．1．3 试验试剂

2．1．4 仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 培养基的制备

2．2．2 高产GABA乳酸菌的筛选

2．2．3 高产GABA乳酸菌发酵条件的研究

2．2．4 发酵液中菌体去除的研究

2．2．5 活性炭脱色条件的研究

2．2．6 大孔吸附树脂脱色条件及其再生的研究

2．2．7 离子交换树脂分离GABA的研究

2．2．8 GABA的结晶

2．3 检测方法

2．3．1 GABA标准曲线与含量的测定

2．3．2 发酵液中生物量的测定

2．3．3 发酵液pH值与蛋白质含量的测定

2．3．4 发酵液浊度降低比的测定

2．3．5 GABA损失率与得率的测定

2．3．6 大孔吸附树脂的脱色率与解吸率的测定

2．3．7 色素吸收波长的测定

2．3．8 离子交换树脂对GABA交换量的测定

2．3．9 高效液相色谱法进行GABA纯度的测定

3 结果与分析

3．1 标准曲线的绘制

3．2 高产GABA菌株的筛选

3．3 高产GABA乳酸菌发酵条件的确定

3．3．1 营养因子对菌株发酵富集GABA的影响

3．3．2 黄浆水培养基的优化

3．3．3 菌株在黄浆水培养基中发酵条件的单因素试验

3．3．4 菌株发酵产GABA过程的研究

3．4 培养液中菌体的去除

3．4．1 絮凝剂对发酵液中菌体去除效果的影响

3．4．2 壳聚糖除菌的单因素试验

3．4．3 壳聚糖絮凝降低发酵液浊度比的响应面优化试验

3．5 色素吸收波长的确定

3．5．1 色素紫外-可见吸收光谱

3．5．2 色素最大吸收波长的确定

3．6 活性炭脱色效果

3．6．1 活性炭脱色单因素试验

3．6．2 活性炭脱色正交优化试验

3．7 大孔吸附树脂脱色效果

3．7．1 大孔吸附树脂的筛选

3．7．2 D101大孔吸附树脂静态脱色试验

3．7．3 D101大孔吸附树脂脱色的动态试验

3．7．4 D101大孔吸附树脂的再生处理

3．8 离子交换树脂分离GABA

3．8．1 离子交换树脂的筛选

3．8．2 D001离子交换树脂静态交换GABA试验

3．8．3 D001离子交换树脂动态交换GABA试验

3．8．4 D001离子交换树脂柱上GABA洗脱试验

3．9 GABA的结晶与纯度的鉴定

3．9．1 GABA的结晶

3．9．1 GABA纯度的鉴定

4 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文