猪原始生殖细胞的生物学特性及bFGF对其克隆形成率的影响

摘要

原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）经体外培养后可形成胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EGCs）。胚胎发育初期，单能性的PGCs向生殖嵴迁移的同时大量增殖，进入生殖嵴后，PGCs经历了表观遗传重编程并最终分化为配子;在体外适宜的培养条件下，PGCs向生殖细胞的特化被阻断，重编程为能够自我更新且具多向分化潜能的EGCs。目前，对于该过程机制的研究主要集中在小鼠上，猪上的报道多是关于EGC建系的尝试和PGC特化相关的表观遗传学调控的研究，而对于猪PGCs本身生物学特性、特别是其重编程过程中多能性、生殖系标志基因表达模式的研究鲜有报道。然而，该方面的探索不仅有利于猪EGCs的最终建系，还对猪生殖细胞体内发育机制的阐述具有重要意义。鉴于此，本课题以猪PGC为研究对象，探索了PGCs体外重编程为EGCs过程中的生长行为变化，多能性、生殖系标志基因及信号通路受体的表达模式，以及bFGF在该过程中的作用，从而为探索猪PGCs体外重编程的作用机理和最终获得具有多能性且稳定传代的EGCs提供理论基础。主要研究结果如下: (1)通过组织切片的HE染色观察到在24天的胚胎中，生殖嵴呈狭长状且紧贴在中肾内层;在26天的胚胎中，生殖嵴变厚，呈现微突起，此时生殖嵴开始与中肾分离;在28天的胚胎中，生殖嵴发育成梭形，呈隆起状，此时生殖嵴已经完全脱离中肾形成独立的组织结构，并且开始两性分化;在30天的胚胎中就可以观察到生殖嵴向雌雄个体的生殖腺发育。 (2)在无血清的培养液中添加抑制分化的细胞因子培养新鲜分离的PGCs，5天后可形成EGCs样的克隆;在自发分化实验中，克隆可向神经样的细胞、成纤维细胞样的细胞、上皮样的细胞分化，也可在体外形成拟胚体;在多能性基因检测中，免疫荧光结果显示，EGCs样克隆的Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-3均呈阳性表达，RT-PCR结果显示，EGCs样克隆的Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、Klf4的表达水平显著高于猪胎儿成纤维细胞;在生殖系标志基因检测中，免疫荧光结果显示，Stella在EGCs样克隆中表达，而Blimp1不表达，RT-PCR结果显示，EGCs样克隆中Blimp1的表达显著低于猪胎儿成纤维细胞，而Ifitm3的表达显著高于中猪胎儿成纤维细胞， Stella和Nanos1的表达量在二者中的差异不显著。 (3)设定三组不同的培养液，第一组培养液中不含任何生长因子;第二组培养液中仅含有Lif和SCF细胞因子;第三组培养液含有Lif、SCF和bFGF三种细胞因子。以相同密度接种新鲜分离的PGCs于这三组培养液中，发现在第一组培养液中几乎没有克隆产生;在第二组培养液中有少量的克隆产生;在第三组培养液，产生的克隆数较多，平均一个生殖嵴的PGCs可形成大约26个的克隆。随后我们对bFGF对PGCs的克隆形成率进行了统计，发现克隆形成率依赖于bFGF浓度及添加时间。在培养液中添加5ng/ml bFGF时，克隆形成数达到最高值;在0d时添加bFGF，PGCs形成的克隆数最多。为了验证bFGF的时间依赖效应，将bFGF在不同时间点撤除，同时加入bFGF的抑制剂，结果发现bFGF还具有抑制PGCs凋亡的作用，随后进行的细胞凋亡检测也验证了此结论。 综上所述，本研究初步探索了猪PGCs的生物学特性，并发现bFGF对PGCs体外重编程具有促进作用，同时还具有抑制PGCs在体外培养过程中凋亡的作用，为体外获得真正意义上的ESCs提供了实验及理论基础。

目录

声明

摘要

1．引言

1．1 胚胎干细胞研究进展

1．1．1 胚胎干细胞(ESCs)的研究进展

1．1．2 猪胚胎干细胞(ESCs)的研究进展

1．2 哺乳动物原始生殖细胞的发育

1．2．1 原始生殖细胞的特化

1．2．2 原始生殖细胞的迁移

1．2．3 原始生殖细胞甲基化的去除与重建

1．3 影响原始生殖细胞重编程的细胞因子

1．3．1 白血病抑制因子(leuckemia inhibitory factor，Lif)

1．3．2 干细胞因子(Stem Cell Factors，SCF)

1．3．3 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)

1．3．4 腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin)

1．3．5 碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 常用试剂及配制

2．1．5 主要的生物信息学网站及分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 猪生殖嵴组织学切片制作

2．2．2 猪生殖嵴的苏木素-伊红染色

2．2．3 猪生殖嵴的碱性磷酸酶染色

2．2．4 猪原始生殖细胞的培养

2．2．5 猪原始生殖细胞的碱性磷酸酶检测

2．2．6 猪原始生殖细胞的分化能力检测

2．2．7 免疫荧光检测

2．2．8 基因表达检测

3 结果

3．1 猪胚胎生殖嵴的发育

3．2 猪原始生殖细胞的生物学特性

3．2．1 猪原始生殖细胞的获得

3．2．2 猪原始生殖细胞的生长行为

3．2．3 猪类胚胎生殖细胞的体外分化

3．2．4 猪类胚胎生殖细胞的多能性及生殖系基因的表达

3．3 bFGF对原始生殖细胞克隆形成的影响

3．3．1 猪类胚胎生殖细胞表面受体的表达

3．3．2 碱性成纤维生长因子对原始生殖细胞克隆形成的影响

4 讨论

4．1 猪原始生殖细胞的生长行为

4．2 bFGF对猪原始生殖细胞重编程的影响

4．3 生殖系基因在猪类胚胎生殖细胞中的表达

4．3．1 Blimp1在类胚胎生殖细胞中的表达

4．3．2 Stella在类胚胎生殖细胞中的表达

4．3．3 Ifitm3在类胚胎生殖细胞中的表达

4．3．4 Nanos1在类胚胎生殖细胞中的表达

4．4 多能性基因在猪类胚胎生殖细胞中的表达

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文