作物秸秆栽培的黑木耳子实体耐旱机制

摘要

随着国家天然林保护的实施和停伐范围的不断扩大，导致木屑资源市场供应不断减少，严重地制约了黑木耳产业的发展。另一方面，国家又是作物秸秆大国，秸秆资源极为丰富。然而作物秸秆随意丢弃或就地焚烧的现象随处可见，既浪费了资源，又污染了环境。因此，作物秸秆完全或部分替代木屑栽培黑木耳受到广泛关注，而且栽培后的废料可作为有机肥提高作物的产量和品质。因此，大力发展作物秸秆栽培黑木耳对促进作物产业和黑木耳产业具有良好的经济效益、生态效益和社会效益，也对生态农业可持续性发展以及农业生态环境保护具有重要的意义。
　　在黑木耳栽培过程中，干旱是影响产量最大的环境胁迫因子。对于一般生物（绝大数陆生植物和蕈菌）营养体来说，干旱胁迫严重时可使其干枯、死亡，即使解除了干旱胁迫，也很难恢复其生命特征。然而黑木耳（Auricularia auricula）子实体在干旱胁迫下，虽然干燥但却并未死亡，当环境条件合适时可以吸水继续生长。由此可见，与其他生物营养体相比，黑木耳子实体极强的耐旱性。在干旱胁迫下，黑木耳子实体这种很强的生存能力、独特的生存方式及生命现象在真核生物界非常罕见。目前，还未见黑木耳耐旱机制研究相关报道。
　　基于这一研究背景，利用作物秸秆栽培黑木耳（配方:木屑30％、豆秸43％、玉米芯10％、麦麸15％、石膏1％和石灰1％）。待耳片长至直径2cm左右采摘后在阳光下自然干燥，当失水率达到0％（对照）、10％、30％、50％和70％时，收集样品作为试验材料，在生理学和分子生物学水平上研究黑木耳子实体的耐旱机制。本研究成果对理解生命在干旱条件中生命的生存方式及其现象的多样性，丰富生物耐旱理论具有重要的科学价值和意义;为黑木耳子实体抗逆性研究提供了依据和参考;为黑木耳子实体分子生物学深入研究提供了丰富的基因资源;也为黑木耳基因工程育种奠定了基础。研究内容和主要研究结果如下:
　　1.干旱胁迫对黑木耳子实体的伤害
　　与对照相比，丙二醛(MDA)含量和细胞膜透性在失水过程中差异不显著，表明黑木耳子实体在干旱胁迫条件下没有受到伤害。
　　2.黑木耳子实体耐旱的生理机制
　　(1)渗透调节作用:可溶性蛋白含量在失水过程中(10％～70％)急剧升高;而可溶性糖、可溶性多糖和可溶性氨基酸含量在失水率50％和70％大幅增加。这些物质均能在干旱胁迫条件下发挥渗透调节作用，以保护黑木耳子实体。其中可溶性蛋白渗透调节能力最强。
　　(2)抗氧化系统:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)在失水过程中(10％～70％)酶活力大幅提高，是清除氧自由基(ROS)的第一道防线;抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量在失水率50％和70％升高，脯氨酸含量仅在失水率70％时升高，构成了清除ROS第二道防线。抗氧化系统这二道防线能有效地清除干旱胁迫诱导的过量ROS，保护黑木耳子实体免受氧化伤害。
　　(3)呼吸酶:苹果酸脱氢酶(MDH)酶活力在失水过程中(10％～70％)急剧下降，在失水率50％和70％降至零，表明干旱胁迫抑制三羧酸循环(TCA);葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)联合酶活力在失水过程中（10％～70％）持续升高，说明磷酸戊糖途径(PPP)是黑木耳子实体在干旱胁迫下主要呼吸途径，可提供大量NADPH用于清除 ROS和代谢。
　　(4)黑色素:黑色素含量失水率在30％～70％持续增加，有利于吸收紫外线和清除ROS，为黑木耳子实体在干旱胁迫和光胁迫中提供保护。
　　3.黑木耳子实体耐旱的分子机制
　　失水率为0％的黑木耳子实体为对照(C)，失水率为30％、50％和70％的黑木耳子实体等量混合物为处理(T)，采用SMART策略构建了cDNA抑制性消减杂交(Suppression SubtractiveHybridization，SSH)文库。正向库(T+C):Tester为T的cDNA，Driver为C的cDNA;反向库(C+T):Tester为C的cDNA，Driver为T的cDNA。
　　(1)测序结果:两个文库的所有克隆测序后，序列经过去载体和接头、聚类和拼接获得305个表达序列标签(ESTs)，其中正向库146个，反向库159个。
　　(2)同源性比对:在NCBI数据库，用Blastx对所有ESTs进行同源性比对，得到96个同源性高且蛋白质功能明确的ESTs（正向库39个，反向库57个），209个同源性较高但蛋白质功能为推测的ESTs（正向库107个，反向库102个），80个未查到或同源性较低的ESTs（正向库47个，反向库33个）。
　　(3)差异表达基因:根据ESTs编码蛋白质的信息，将96个蛋白质功能明确的ESTs分为9个类别。差异ESTs分析结果表明在干旱胁迫过程中，黑木耳子实体通过信号转导通路的变换，开启防御系统增强耐旱能力。差异表达基因功能分类及耐旱ESTs的作用如下:
　　1)碳水化合物代谢:纤维素酶、岩藻糖酶、木糖苷酶与阿拉伯呋喃糖苷酶上调表达（正向库ESTs）可将纤维素、半纤维素等多糖类物质分解为可溶性糖;葡聚糖磷酸化酶、β-葡聚糖合成酶和CoA合成酶上调表达促进了可溶性多糖合成。可溶性糖和可溶性多糖含量提高，可增强黑木耳在干旱胁迫时的渗透保护作用。
　　2)蛋白质代谢:翻译起始因子eIF2和肽基脯氨酰异构酶上调表达，可增强蛋白质合成;脯氨酰肽酶、丝氨酸羧肽酶、真菌酸性蛋白酶、肌酸酶/氨基肽酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及泛素支架蛋白Cullin下调表达（反向库ESTs）降低了蛋白质分解速度。蛋白质合成增强、分解下降，有利于积累蛋白质，可提高黑木耳在干旱胁迫时的渗透保护作用和增强耐早相关蛋白的合成。
　　3)氨基酸代谢:邻氨基苯甲酸合成酶和谷氨酰胺水解酶上调表达可促进色氨酸和谷氨酸合成，金属依赖性肽酶和26S蛋白酶体的硫氧还蛋白域上调表达也可通过蛋白质分解增加氨基酸含量。氨基酸含量增加，可为黑木耳在干旱胁迫下增强渗透保护作用。
　　4) DNA稳定相关:ⅡB型拓扑异构酶、错配碱基对和十字形DNA识别蛋白、3-磷酸多核苷酸激酶上调表达，增强了DNA超螺旋结构的解旋和恢复能力;染色体分离ATP酶上调表达，可增加染色体结构的稳定性和促进染色体分离。
　　5)转录相关:DNA指导的RNA聚合酶Ⅰ上调表达，可促进核糖体rRNA转录，有利于蛋白质合成;RNA依赖的RNA聚合酶、转录调控因子、沉默信息调节因子2、RNA解旋酶的下调表达，可控制黑木耳子实体某些特定基因在干旱胁迫下的表达和沉默。
　　6)信号转导:促分裂原活化蛋白激酶、RCK1蛋白激酶上调表达以及WD40重复蛋白下调表达，可提高清除ROS能力和增强渗透调节作用;CDK细胞周期蛋白依赖性激酶A上调表达，可加速黑木耳子实体休眠进程。
　　7)胞内胞外运输:网格衔接蛋白复合物σ亚基APS2、胞外分泌复合体Sec10亚基、主要促进超家族转运蛋白及氯离子通道蛋白上调表达，可促进蛋白质、小分子物质和无机离子等的分泌和运输，以增强黑木耳子实体耐旱性。
　　8)能量产生与转换:细胞色素C氧化酶亚单位1上调表达，可促进电子传递链ATP合成;GSH依赖的甲醛脱氢酶、Zn依赖的乙醇脱氢酶、FAD依赖的脱氢酶和Aldo-酮还原酶上调表达，可促进还原力合成，参与清除ROS及有毒物质。
　　9)细胞防御:细胞色素P450、芳香胺N-乙酰基转移酶、羧酸酯酶和腈水解酶上调表达，有利于清除体内外的毒素;乳酰谷胱甘肽水解酶和过氧化物酶体合成因子1上调表达，不仅提高GSH、AsA和VE含量和SOD、CAT和POD等酶活力以清除ROS等自由基和毒素，还可加快生物氧化进程;CRISPR/CAS系统上调表达，可防止外源生物及其DNA入侵;热激蛋白70上调表达，有利于蛋白质新陈代谢、结构与功能稳定及运输。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 作物秸秆利用

1．2 作物秸秆栽培食用菌

1．3 黑木耳研究进展

1．3．1 黑木耳的形态结构

1．3．2 黑木耳生理学研究

1．3．3 黑木耳分子生物学研究

1．4 干旱胁迫的伤害机制及生物耐旱性机理研究进展

1．4．1 干旱胁迫的伤害机制

1．4．2 生物耐旱机制

1．5 本研究的目的、意义及创新点

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 黑木耳菌种

2．1．2 黑木耳栽培

2．1．3 采样

2．2 试验方法

2．2．1 细胞膜透性测定

2．2．2 丙二醛测定

2．2．3 可溶性糖测定

2．2．4 可溶性氨基酸测定

2．2．5 脯氨酸测定

2．2．6 可溶性多糖测定

2．2．7 可溶性蛋白测定

2．2．8 抗坏血酸测定

2．2．9 还原型谷胱甘肽测定

2．2．10 SOD测定

2．2．11 CAT测定

2．2．12 POD测定

2．2．13 磷酸己糖异构酶(PGI)测定

2．2．14 苹果酸脱氢酶(MDH)测定

2．2．15 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶

2．2．16 黑色素测定

2．2．17 抑制性消减杂交文库构建

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 膜的稳定性

3．1．1 丙二醛

3．1．2 细胞膜透性

3．2 渗透调节物质

3．2．1 可溶性糖

3．2．2 可溶性多糖

3．2．3 可溶性蛋白

3．2．4 可溶性氨基酸

3．3 抗氧化系统

3．3．1 抗坏血酸

3．3．2 还原型谷胱甘肽

3．3．3 脯氨酸

3．3．4 超氧化物歧化酶

3．3．5 过氧化氢酶

3．3．6 过氧化物酶

3．4 呼吸酶

3．3．4 磷酸己糖异构酶

3．3．5 苹果酸脱氢酶

3．3．6 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶

3．5 黑色素

3．6 SSH文库构建及ESTs分析

3．6．1 总RNA检测

3．6．2 cDNA扩增

3．6．3 RsaⅠ酶切

3．6．4 接头连接

3．6．5 消减杂交效率

3．6．6 ESTs分析

3．7 差异表达基因功能分类

4 讨论

4．1 膜的稳定性

4．2 黑木耳耐旱的生理机制

4．2．1 渗透调节物质

4．2．2 抗氧化系统

4．2．3 呼吸酶

4．2．4 黑色素

4．3 黑木耳耐旱的分子机制

4．3．1 碳水化合物代谢

4．3．2 蛋白质及氨基酸代谢

4．3．3 DNA稳定相关

4．3．4 转录相关

4．3．5 信号转导

4．3．6 胞内胞外运输

4．3．7 能量产生与转换

4．3．8 细胞防御

5 结论

5．1 干旱胁迫对黑木耳子实体的伤害

5．2 黑木耳子实体耐旱的生理机制

5．3 黑木耳子实体耐旱的分子机制

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文