兴凯湖翘嘴鲌肌苷酸含量变化及AMPD1基因克隆与表达

摘要

翘嘴鲌（Culter alburnus）是中国名贵的鲤科（Cyprinidae）淡水鱼类，具有很高的经济价值。兴凯湖翘嘴鲌体银白色，肉质细嫩，其优良的肉质性状受到广泛关注。但由于过度捕捞，导致其天然资源日益减少，市场需求日趋紧张。因此，翘嘴鲌的人工养殖前景较好。鱼肉受消费者欢迎主要由于其营养丰富，肉质及风味良好。当前，国内外对体肌中肌苷酸(Inosine-5'-Monophosphate，IMP)水平的研究较多，从分子水平展开对鱼类肉质相关基因的研究也越来越多，越来越多的鱼类风味候选基因被逐步发掘出来，但不同储藏温度下IMP含量变化规律、不同生长时期IMP含量差异以及与IMP生成代谢密切相关的腺苷一磷酸脱氨酶(Adenosine5'-monophosphate deaminase，AMPDI)基因的研究还很少。
　　本研究运用高效液相色谱技术测定翘嘴鲌2龄、3龄、4龄养殖群体及4龄野生群体，在(20±1)℃、4℃、-20℃贮存条件下肌肉组织中肌苷酸（IMP）含量及其变化规律。根据Genbank中已知的鲤科鱼类AMPD1基因序列设计引物，采用PCR技术和RACE技术首先克隆出翘嘴鲌腺苷一磷酸脱氨酶（AMPD1）的部分cDNA序列，再利用获得的序列设计引物扩增出包含3'UTR和5'UTR的其他部分的cDNA序列，将所得序列进行拼接，得到全序列;采用荧光定量PCR技术(Real-time PCR)检测AMPD1基因在兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织中的表达量。试验结果如下:
　　(1)2龄未经贮存(0h)肌肉组织IMP含量为3.4297mg/g，2龄和3龄群体IMP含量显著高于4龄IMP含量(p＜0.05)。在3个贮存条件下，肌肉组织IMP含量在温度较高条件下降解速度更快，而冷冻保存肌肉组织测得结果显示IMP含量均较高，且降解缓慢。不考虑年龄和温度变化的影响，IMP含量与肌肉组织的贮存时间也有关系:IMP含量达到峰值后，贮存时间与IMP含量呈负相关。建议保存温度为低温冷冻，且7d内食用最佳。
　　(2)获得了翘嘴鲌AMPD1基因cDNA序列全长2592bp,Genbank登录号为KP735961。其中包括完全的CDS区序列长度为2154bp，完整的3'UTR区片段大小为351bp，5'UTR区片段大小为87bp。预测编码717个氨基酸和一个终止密码子。
　　(3)通过Blast比对显示翘嘴鲌AMPD1基因核苷酸序列CDS区与斑马鱼（Danio rerio）的同源性高达89％;而其氨基酸同源性比对结果显示与欧洲川鲽（Platichthys flesus）同源性为84％;与斑马鱼（Danio rerio）氨基酸同源性较高为93％，且编码的氨基酸数目与斑马鱼相同，均编码717个氨基酸。比对兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因的核苷酸序列和氨基酸序列均显示，其与鲤科鱼类的同源性更高。
　　（4)对兴凯湖翘嘴鲌2龄、3龄、4龄养殖群体和4龄野生群体肌肉组织进行AMPD1基因表达分析。Real-time PCR结果表明，2龄翘嘴鲌AMPD1基因mRNA表达量最高，3龄表达量次之，显著高于野生和养殖群体4龄肌肉组织表达量(p＜0.05);4龄野生群体肌肉组织表达量显著高于4龄养殖群体肌肉组织表达量(p＜0.05)。AMPD1基因表达量随年龄递减。AMPD1表达量与IMP含量呈正相关。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究背景

1．2 肌苷酸(IMP)及其研究进展

1．3 影响IMP含量的因素

1．4 腺苷一磷酸脱氨酶

1．4．1 AMPD1基因的结构

1．4．2 AMPD1基因的功能

1．4．3 AMPD1基因的研究进展

1．5 研究的目的与意义

1．6 研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 样本采集与处理

2．2 实验仪器设备

2．3 实验试剂及药品

2．4 工具酶及试剂盒

2．5 试验方法

2．5．1 IMP含量的测定

2．5．2 兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织RNA的提取

2．5．3 紫外分光光度计检测RNA

2．5．4 琼脂糖凝胶电泳检测RNA

2．5．5 总RNA反转录成cDNA

2．5．6 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因的克隆

2．5．7 肌肉组织中AMPD1基因mRNA的表达

2．5．8 数据的统计与结果分析

3 结果与分析

3．1 IMP含量分析

3．1．1 IMP标准品色谱分析和标准曲线分析

3．1．2 贮存温度和贮存时间对兴凯湖翘嘴鲌肌肉IMP含量的影响

3．1．3 不同时期兴凯湖翘嘴鲌IMP含量变化比较

3．1．4 兴凯湖翘嘴鲌4龄野生和养殖群体IMP含量分析

3．2 AMPD1基因分析

3．2．1 肌肉组织总RNA的检测

3．2．2 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因克隆及序列分析

3．2．3 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因进化树分析

3．2．4 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因在肌肉组织中的表达

4 讨论

4．1 贮存温度和贮存时间对兴凯湖翘嘴鲌肌肉IMP含量的影响

4．2 兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织IMP含量分析比较

4．2．1 不同时期兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织IMP含量分析比较

4．2．2 野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织IMP含量分析比较

4．3 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因的克隆、分析及表达

4．3．1 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因的克隆

4．3．2 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因的同源性及进化分析

4．3．3 兴凯湖翘嘴鲌AMPD1基因在不同时期肌肉组织中的表达差异

4．4 IMP含量与AMPD1基因表达关系

4．5 研究展望

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文