α-突触核蛋白在阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬中的作用研究

摘要

阿维菌素(Avermectin，AVM)广泛地应用于农业以及畜牧业，具有较高的安全性，驱虫效果也很好，随着其使用量的增加，阿维菌素在环境中的残留量也随之增加。我们实验室在之前的工作中发现，阿维菌素暴露能够引起王鸽神经中毒的症状，随后研究发现阿维菌素可以导致王鸽脑神经细胞自噬样形态学变化。应用蛋白免疫印迹方法检测王鸽急性阿维菌素暴露，发现阿维菌素可以诱导α-突触核蛋白在王鸽脑组织中的表达水平显著升高。由于α-突触核蛋白与神经细胞的自噬作用具有相关性。为了探究阿维菌素诱导的王鸽脑神经细胞自噬中α-突触核蛋白基因的作用，本研究制备王鸽胚脑神经细胞阿维菌素染毒模型并对α-突触核蛋白基因进行敲低，对其敲低前后王鸽胚脑神经细胞超微结构使用透射电镜技术进行观察，检测了自噬相关基因的核酸和蛋白的表达水平，对于在阿维菌素诱导的王鸽神经细胞自噬模型中α-突触核蛋白的作用进行了讨论。结果如下：
　　(1)制备抗王鸽动力蛋白多克隆抗体。对新西兰大白兔进行5次背部多点注射免疫后，对抗体的效价进行了检测，结果为1∶25600。此抗体可以对王鸽脑细胞中动力蛋白的蛋白水平进行检测。
　　(2)将鸽胚于孵化箱中孵化7-8天后按照常规方法应用Neurobasal商品化培养基对王鸽脑神经细胞的培养方式进行优化。使用神经细胞烯醇化酶免疫染色对王鸽胚脑神经细胞进行了鉴定。
　　(3)使用Stealth RNA(S-RNA)对王鸽胚脑神经细胞进行了细胞转染，转染效率较高。
　　(4)通过荧光定量PCR和Western Bolt技术检测自噬相关基因，发现王鸽胚脑神经细胞在阿维菌素染毒后，TOR在核酸水平的表达受到明显的抑制，LC3、Beclin1、Dynein的蛋白及核酸水平均增加，增加了ATG5、ATG4B核酸水平的表达，比较于敲低前，敲低α-突触核蛋白基因后LC3、Beclin1、Dynein、ATG5、ATG4B的核酸水平显著降低。这些结果提示阿维菌素染毒诱导了王鸽胚脑神经细胞的自噬作用;敲低α-突触核蛋白基因后阿维菌素对神经细胞的毒性作用降低。提示α-突触核蛋白参与阿维菌素引起的王鸽胚脑神经细胞自噬改变。
　　(5)通过透射电镜检测技术发现，王鸽胚脑神经细胞阿维菌素染毒后自噬体数量增加，自噬水平升高，敲低α-突触核蛋白基因后，自噬体数量较染毒组数量明显减少。同样提示α-突触核蛋白参与阿维菌素引起的王鸽胚脑神经细胞自噬的改变。
　　综上，阿维菌素可以诱导王鸽胚脑神经细胞超微结构以及自噬相关基因核酸和蛋白表达水平的改变，提高了自噬水平。α-突触核蛋白基因敲低后能够缓解阿维菌素引起的王鸽胚脑神经细胞自噬水平的增加。本研究可以为研究阿维菌素环境毒理学监测分析提供试验基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 阿维菌素概况

1．2 阿维菌素与毒理学

1．2．1 阿维菌素药理作用机制

1．2．2 阿维菌素毒性

1．3 α-突触核蛋白概况

1．3．1 α-突触核蛋白

1．3．2 α-突触核蛋白的功能

1．4 自噬

1．4．1 自噬的检测方法

1．4．2 自噬在毒理学研究中的研究进展

1．5 RNA干扰技术

1．6 试验的目的与意义

2 材料与方法

2．1 主要仪器和试剂

2．1．1 主要的仪器

2．1．2 主要的试剂

2．1．3 主要试剂的配制

2．2 实验材料

2．2．1 鸽胚脑神经细胞的培养及处理

2．2．2 鸽胚脑神经细胞鉴定

2．2．3 王鸽脑神经细胞α-突触核蛋白基因的干扰

2．2．4 鸽胚脑神经细胞的处理

2．3 王鸽Dynein多克隆抗体的制备

2．3．1 引物设计与合成

2．3．2 扩增目的基因

2．3．3 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析

2．3．4 王鸽Dynein基因重组表达载体的构建与鉴定

2．3．5 王鸽Dynein基因在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

2．3．6 抗王鸽Dynein多克隆抗体的制备和鉴定

2．4 检测项目与方法

2．4．1 王鸽脑神经细胞超微结构

2．4．2 王鸽脑神经细胞中自噬相关基因核酸水平的检测

2．4．3 王鸽LC3、Beclin 1和Dynein蛋白表达检测

2．5 数据分析与统计

3 结果与分析

3．1 王鸽Dynein基因扩增结果

3．2 王鸽Dynein基因测序结果

3．3 王鸽Dynein编码区分析结果

3．4 重组蛋白的表达、鉴定与纯化

3．5 抗体的制备和鉴定结果

3．6 鸽胚脑神经细胞形态学观察

3．7 鸽胚脑神经细胞鉴定

3．8 王鸽胚脑神经细胞RNA干扰

3．9 王鸽脑神经细胞超微结构

3．10 王鸽脑神经细胞自噬相关基因mRNA检测结果

3．11 王鸽脑神经细胞自噬相关蛋白检测结果

4 讨论

4．1 王鸽Dynein的克隆、表达及多克隆抗体的制备

4．2 敲低α-突触核蛋白基因对阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬形态超微结构的影响

4．3 敲低α-突触核蛋白基因对阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬相关基因的影响

4．3．1 敲低α-突触核蛋白基因对阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬相关基因TOR的影响

4．3．2 敲低α-突触核蛋白基因对阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬相关基因Beelin 1的影响

4．3．3 敲低α-突触核蛋白基因对阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬相关基因LC3、ATG4B和ATG5的影响

4．3．4 敲低α-突触核蛋白基因对阿维菌素致王鸽脑神经细胞自噬相关基因Dynein的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文