白藜芦醇在砷诱导大鼠肝氧化应激中的作用研究

摘要

砷是一种广泛存在于环境中的污染物和致癌物。然而，自古以来人们恰恰利用砷的毒性来治疗疾病和防治虫害。同时，砒霜(Arsenic trioxide，As2O3)也被认为是早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)的良药，然而在使用As2O3治疗APL的过程中，会出现明显的肝毒性。因此，如何有效的降低砷暴露人群的砷毒性以及治疗过程中的毒副作用成为了国内外研究的热点课题。目前，关于砷的毒性机制国内外研究结果显示:诱导自由基(Reactive oxygen species，ROS)的产生在毒性研究中处于核心位置，因其伴随毒性的整个过程。而大量的研究资料表明，抗氧化剂的使用可以有效地降低过多自由基的产生。
　　白藜芦醇(Resveratrol，RES)化学名称为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯，属于非黄酮类多酚化合物。在植物中，RES会在微生物感染、过度紫外线照射和疾病感染时产生，因此又属于植物素。大量的研究证实RES具有抗炎、自由基清除、心血管保护、抗肿瘤和抗衰老等多种生物学活性。因此，本研究运用细胞生物学和分子生物学技术，通过体内（正常健康大鼠、砷暴露大鼠、RES处理大鼠及同时处理大鼠）和体外（原代肝细胞、砷暴露肝细胞、RES添加处理肝细胞及同时处理肝细胞）两条途径，重点评估砷暴露后大鼠肝脏的氧化应激、砷蓄积和肝细胞凋亡等情况，以及RES对其的影响。以8周Wistar大鼠为研究对象，通过分别隔日尾静脉注射8 mg/kg RES和3 mg/kg As2O3，且联合给药组RES先于As2O31h注射，共4次，持续到第8天，建立体内砷暴露模型。我们发现:砷暴露大鼠的血液中出现以丙氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶明显升高的肝损伤和ROS（750.29±81.33 Unites/mL）、脂质物氧化物丙二醛（4.9±0.67μmol/L）过高浓度和超氧化物歧化酶(7.42±1.14Unites/mL)、谷胱甘肽过氧化物酶(215.93±35.19 Unites/L)、过氧化氢酶(3.66±0.32Unites/mL)过低浓度，以这些为主要标志的氧化应激性损伤以及典型的中毒性病理损伤和高出正常组约7倍的砷蓄积;然而，预防性给予RES的大鼠肝组织氧化性和病理性损伤情况均得到缓解且砷的蓄积量也显著降低(p＜0.05)。为了进一步探索As2O3诱导肝细胞氧化应激是否能引发凋亡以及明确凋亡的路径，我们又建立了体外细胞模型。本试验采用原位胶原二步灌流法获取大鼠原代肝细胞，通过分别添加As2O3和RES建立大鼠原代肝细胞试验模型。试验结果表明，As2O3添加影响了原代肝细胞的贴壁生长、造成了肝细胞明显的病理性损伤和诱导了肝细胞的氧化应激，同时，肝细胞的线粒体凋亡路径被激活，主要表现为以Fax/TNF为受体的凋亡在砷暴露前后以及给予RES并无明显性差异，而以Bcl-2和Bax为线粒体的凋亡在砷暴露后均显著性升高，且Bcl-2/Bax的比率明显下降，但Caspase-3的基因表达差异性却不显著。鉴于Caspase-3激活的凋亡是受其活性蛋白调控，又对其活性进行了检测。与正常空白组相比，高砷环境下Caspase-3的活性提高了近10倍，而提前RES处理其活性可减缓20％的升高。在我们的整个试验过程中，单独处理RES对肝组织和肝细胞均无明显可见差异。综上所述:给予低剂量的RES可以有效地降低As2O3诱导肝脏氧化性损伤，肝细胞凋亡和砷蓄积，从而降低了肝脏的病理性损伤，同时，RES也可以降低As2O3通过Bcl-2/Bax线粒体路径诱导的凋亡。由此可见预处理的RES降低了以药物砷对正常健康大鼠诱导产生的氧化应激、肝细胞凋亡，从而减缓了肝脏损伤。但是RES是否调控与凋亡密切相关的自噬等问题还需进一步明确。本研究有望在砷和RES协同抗肿瘤的临床应用和砷污染的防治问题提供理论依据和实践基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 砷

1．1．1 砷的应用

1．1．2 砷的药理作用

1．2 白藜芦醇

1．2．1 RES的生物活性

1．2．2 RES的抗癌作用

1．3 目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 试验药品

2．1．3 主要试验试剂与配制

2．1．4 试验仪器与设备

2．2 方法

2．2．1 试验方案

2．2．2 样品采集

2．2．3 大鼠肝毒性检测

2．2．4 大鼠肝细胞毒性检测

2．3 数据处理

3 结果

3．1 RES在砷诱导的肝毒性中的作用

3．1．1 砷诱导大鼠肝毒性

3．1．2 RES在砷诱导大鼠肝毒性中的作用

3．2 RES在砷诱导的肝细胞毒性中的作用

3．2．1 原代分离培养肝细胞的鉴定

3．2．2 砷诱导大鼠肝细胞肝毒性

3．2．3 RES在砷诱导大鼠的肝毒性中的作用

4 讨论

4．1 RES在砷诱导的大鼠肝毒性中的作用

4．2 RES在砷诱导的大鼠肝细胞中毒性的作用

4．3 展望

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文