信号肽、Kozak序列、n-糖基化对黑曲霉表达木聚糖酶的影响

摘要

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，在自然界中分布广泛，木聚糖酶(D-xylanxylanohydrolaseEC3.2.1.8)是降解木聚糖的主要酶类，属于水解酶。主要应用于酿酒、饲料、造纸、食品等工业中。目前，食品级木聚糖酶主要是利用黑曲霉等丝状真菌进行发酵生产。但这些方法普遍存在酶活不高，产量低等缺点。利用基因工程技术，构建高量表达的木聚糖酶食品级工程菌是解决这一问题的有效途径。
　　本实验室前期以糖化酶生产菌黑曲霉CICC2462为受体菌，构建了1株分泌表达木聚糖酶的黑曲霉工程菌，其摇瓶发酵酶活达到4495.89U/ml。在此基础上，本研究通过改变信号肽序列、添加kozak序列、N-糖基化修饰等方法对木聚糖酶基因进行改造，探讨进一步提高木聚糖酶的表达量和稳定性的方法。
　　主要研究结果如下:
　　1.木聚糖酶基因的改造及表达载体的构建
　　利用PCR技术，扩增出带有糖化酶基因信号肽的黑曲霉木聚糖酶基因xynBm2、带有糖化酶基因信号肽和kozak序列的黑曲霉木聚糖酶基因xynBm3基因。利用重叠延伸PCR技术扩增出不同N-糖基化修饰的黑曲霉木聚糖酶基因xynBNG1、xynBNG2、xynBNG3。将其与黑曲霉表达载体pSZHG连接，构建黑曲霉表达载体pSZHG-xynBm2、pSZHG-xynBm3、pSZHG-xynBNG1、pSZHG-xynBNG2、 pSZHG-xynBNG3。
　　2.黑曲霉的转化及同源重组转化子的鉴定
　　采用冻融法将表达载体转化到农杆菌中AGLI中，通过农杆菌介导法将木聚糖酶基因转入到黑曲霉中。提取黑曲霉的DNA，经PCR鉴定，发现pSZHG-xynBm2、pSZHG-xynBm3、pSZHG-xynBNG1、pSZHG-xynBNG2、pSZHG-xynBNG3的阳性转化子都是同源重组菌株。同源重组转化子继代培养后，筛选得到pSZHG-xynBm2纯合菌株。
　　3.木聚糖酶基因在重组菌株中的表达分析
　　取重组菌株的发酵液上清，进行酶活检测，pSZHG-xynBm2重组菌株最高酶活为2525U/ml，pSZHG-xynBm3重组菌株最高酶活为7710U/ml，pSZHG-xynBNG1重组菌株最高酶活为5907U/ml; pSZHG-xynBNG2重组菌株最高酶活为3074U/ml; pSZHG-xynBNG3重组菌株最高酶活为2305U/ml。
　　经糖基化修饰的三个基因xyn BNG1、xynBNG2、xynBNG3的最适温度均为45℃，最适pH值均为7。xynBNG1基因在高于50℃时酶活下降明显，xynBNG2基因在高于55℃时酶活下降明显，xynBNG3基因在高于45℃时酶活下降明显。在不同温度下保温1h，检测木聚糖酶的残余酶活，随着热处理温度上升，酶活也开始下降，40℃下处理1h后酶活性分别是未处理组酶活的82.6％、69.4％、70.0％，而在50℃处理同样时间，相对酶活仅为60.8％、65.5％、65.1％，均有所下降。
　　用荧光定量PCR技术，比较几个基因在转录水平上基因表达差异。转化子pSZHG-xynBm2的表达量低于对照组pSZHG-xynB基因45％，基因整合的靶位点的糖化酶基因mRNA水平降低为出发菌株的6.9％; pSZHG-xynBm3的表达量相对于对照组pSZHG-xynB基因提高了1.68倍，基因整合的靶位点的糖化酶基因mRNA水平降低为出发菌株的7.3％。
　　结果表明，以糖化酶的信号肽替代木聚糖酶的信号肽降低了木聚糖酶在黑曲霉中的表达量。添加kozak序列可有效提高木聚糖酶的表达量。N-糖基化修饰提高木聚糖酶的热稳定性的效果不明显，其对提高木聚糖酶表达量的作用有待于获得纯合重组菌株后再作评价。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 信号肽的概述

1．2．2 蛋白质糖基化的介绍

1．3 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和载体

2．1．2 酶和主要生物化学试剂

2．1．3 常用试剂的配置

2．1．4 培养基

2．1．5 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 黑曲霉基因组的提取

2．2．2 基因克隆

2．2．3 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化

2．2．4 同源重组转化子的鉴定

2．2．5 重组菌株中木聚糖酶基因的表达检测

2．2．6 重组菌株的木聚糖酶活性测定

2．2．7 重组菌株中木聚糖酶的酶学性质

3 结果与分析

3．1 木聚糖酶基因的改造

3．1．1 木聚糖酶xynBm2基因的扩增

3．1．2 木聚糖酶xynBm3基因的扩增

3．1．3 木聚糖酶xynBNG1基因的扩增

3．1．4 木聚糖酶xynBNG2基因的扩增

3．1．5 木聚糖酶xynBNG3基因的获得

3．2 表达载体的构建

3．3 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化

3．3．1 农杆菌转化子的PCR鉴定

3．3．2 农杆菌介导法转化黑曲霉

3．4 同源重组菌株的鉴定

3．4．1 阳性转化子的鉴定

3．4．2 xynB基因同源重组转化子的筛选

3．5 重组菌株中木聚糖酶基因的表达检测

3．5．1 木聚糖酶转录水平检测

3．5．2 木聚糖酶的SDS-PAGE检测

3．5．3 木聚糖酶的酶活检测

3．6 木聚糖酶的酶学性质

3．6．1 温度对酶活力的影响及温度稳定性

3．6．2 pH对酶活力的影响

4 讨论

4．1 信号肽和kozak序列对木聚糖酶基因表达的影响

4．2 糖基化对木聚糖酶基因表达的影响

5 结论

5．1 信号肽和kozak序列对木聚糖酶基因表达的影响

5．2 糖基化对木聚糖酶基因表达的影响

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文