TGase诱导的壳寡糖糖基化与交联对两种蛋白质的性质影响

摘要

酪蛋白和大豆蛋白是重要的食品蛋白质，必需氨基酸组成合理。但任何单一来源的蛋白质都不能满足食品加工中的全部要求，因此蛋白质改性是十分必要的。美拉德反应是一种有效的蛋白质糖基化修饰技术，是将亲水性的糖类分子共价连接到蛋白质分子中，导致蛋白质性质改变。然而，利用该途径糖基化蛋白质时，反应难控制，所需反应时间长;另外，还会生成一些有颜色的副产物。最近的一些研究发现，可以利用转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)的催化特性，将含有伯胺的糖分子导入到蛋白质中，制备糖基化交联蛋白质，提供一个非美拉德途径的蛋白质糖基化方法。该方法安全，有效，是一种新型的蛋白质修饰技术。
　　本研究利用转谷氨酰胺酶，分别催化酪蛋白和大豆蛋白与壳寡糖(5 kDa)发生糖基化交联反应，制备糖基化交联蛋白质。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，高效液相色谱(HPLC)和游离氨基含量的变化对糖基化交联反应进行验证。利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和圆二色谱(CD)分别评估修饰产物的侧链结构和二级结构。最后，评估糖基化修饰反应对蛋白质性质的影响。主要研究结果如下:
　　(1)糖基化交联反应的确认
　　参考前人优化的转谷氨酰胺酶催化蛋白质糖基化交联反应的条件，制备糖基化交联酪蛋白（GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ）和大豆蛋白（GC-大豆蛋白），并对修饰反应进行验证。SDS-PAGE分析结果显示:酪蛋白和大豆蛋白修饰产物为蛋白质聚合物，该聚合物为糖基化的交联蛋白。HPLC分析结果显示:GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ的糖基接入量分别为12.8和30.8g/kg蛋白质;GC-大豆蛋白的糖基接入量为13.6g/kg蛋白质。GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ的游离氨基含量显著低于酪蛋白（从0.62降至0.50和0.52mol/kg蛋白质）;同样的，GC-大豆蛋白和交联大豆蛋白（CL-大豆蛋白）的游离氨基含量显著低于大豆蛋白（从0.50降至0.42和0.43mol/kg蛋白质），且CL-大豆蛋白和GC-大豆蛋白的游离氨基含量没有显著性差异。
　　(2)修饰产物的侧链结构和二级结构
　　FT-IR分析结果表明，转谷氨酰胺酶催化壳寡糖连接于酪蛋白和大豆蛋白分子中。CD分析结果表明，糖基化交联修饰导致酪蛋白的无规则卷曲结构减少，α-螺旋和β-折叠结构增加，即二级结构更加有序;而糖基化交联修饰导致大豆蛋白的α-螺旋和β-折叠结构比例降低，无规则卷曲结构增加，即二级结构更加无序。
　　(3)修饰产物的性质变化
　　1)持水性，吸油性和体外消化性结果显示:与酪蛋白相比，GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ的持水性显著提高，吸油性略有降低;与大豆蛋白和CL-大豆蛋白相比，GC-大豆蛋白的持水性和吸油性均显著提高。此外，糖基化交联修饰导致GC-酪蛋白Ⅰ的体外消化能力下降，GC-酪蛋白Ⅱ的体外消化能力提高;而GC-大豆蛋白的体外消化能力下降。
　　2)糖基化交联修饰导致GC-酪蛋白和GC-大豆蛋白的乳化活性降低，但乳化稳定性提高。表面疏水性结果显示:GC-酪蛋白Ⅰ＞GC-酪蛋白Ⅱ＞酪蛋白;CL-大豆蛋白＞GC-大豆蛋白＞大豆蛋白。与酪蛋白相比，GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ的表观黏度，粘弹性显著提高，且其酸凝胶的质构性质也显著提高;GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ酸凝胶的胶凝时间显著缩短(从210降至125和114min)，胶凝温度显著降低（从72降至66和62℃），凝胶的持水性和容积密度提高，凝胶的微观结构也发生了显著性变化。
　　3)胶体稳定性结果显示:与酪蛋白相比，GC-酪蛋白Ⅰ和GC-酪蛋白Ⅱ的水合半径增大(从145.3至173.9和168.2nm)，zeta-电位增大(从-27.6至-32.9和-30.9mV);同样的，与大豆蛋白和CL-大豆蛋白相比，GC-大豆蛋白的水合半径增大（从82.9和101.0至180.2nm），zeta-电位增大（从-27.7和-30.7至-31.2mV）。热重分析发现，GC-酪蛋白和GC-大豆蛋白的热分解温度降低，且质量损失更大，表明糖基化交联修饰导致蛋白质的热稳定性降低。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 酪蛋白和大豆蛋白

1．2．1 酪蛋白的组成与结构

1．2．2 酪蛋白的功能性质及其应用

1．2．3 大豆蛋白的组成与结构

1．2．4 大豆蛋白的功能性质及其应用

1．3 蛋白质的改性

1．3．1 物理改性

1．3．2 化学改性

1．3．3 酶法改性

1．4 壳寡糖的性质与应用

1．5 研究的目的与意义

1．6 研究的主要内容

1．7 研究的创新点

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要材料与试剂

2．1．2 主要设备与仪器

2．2 试验方法

2．2．1 研究工作的技术路线

2．2．2 蛋白质的糖基化交联修饰反应

2．2．3 修饰产物的结构表征

2．2．4 修饰产物的功能性质表征

2．2．5 修饰产物的胶体稳定性和热稳定性分析

2．2．6 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 酪蛋白的糖基化交联修饰

3．1．1 酪蛋白修饰产物的糖基化交联

3．1．2 酪蛋白修饰产物的结构特征

3．1．3 酪蛋白修饰产物的功能性质

3．1．4 酪蛋白修饰产物的胶体稳定性和热稳定性

3．2 大豆蛋白的糖基化交联修饰

3．2．1 大豆蛋白修饰产物的糖基化交联

3．2．2 大豆蛋白修饰产物的结构特征

3．2．3 大豆蛋白修饰产物的功能性质

3．2．4 大豆蛋白修饰产物的胶体稳定性和热稳定性

4 讨论

4．1 转谷氨酰胺酶催化蛋白质的糖基化交联修饰

4．2 糖基化交联修饰对蛋白质结构的影响

4．2．1 蛋白质糖基化修饰后侧链结构的变化

4．2．2 蛋白质糖基化修饰后二级结构的变化

4．3 糖基化交联修饰对蛋白质一些性质的影响

4．3．1 对持水性和吸油性的影响

4．3．2 对体外消化能力的影响

4．3．3 对乳化性的影响

4．3．4 对表面疏水性的影响

4．3．5 对流变学性质的影响

4．3．6 对胶凝性质的影响

4．3．7 对胶体稳定性的影响

4．3．8 对热稳定性的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文