抗汞益生乳酸菌筛选及其缓解汞毒性机制研究

摘要

重金属污染由于其不可生物降解性、危险性和毒害性不仅使环境受到破坏，更威胁到了人类和动物的公共健康。汞是机体内一种非必需的重金属元素，可以通过食物链积累，大大增加机体受到损害的风险。本研究旨在分离、筛选耐汞益生乳酸菌，完善乳酸菌解重金属中毒的机理，同时为解汞中毒提供一个新的思路及理论基础，为将来乳酸菌作为生物制剂或者动物饲料中的添加剂打下基础。
　　本试验从健康动物肠道内容物中分离出有耐汞特性的乳酸菌，对分离出的菌株进行鉴定及益生试验进行筛选，挑选出具有优良耐汞性能的益生菌株，筛选抗性基因，随后进行动物试验，通过抗氧化应激、细胞因子的检测及p38 MAPK和NF-κB通路的表达来探究筛选的益生乳酸菌解重金属汞中毒的机理。主要研究结果如下:
　　(1)从健康的猪、马、牛、羊、犬和鸡肠道内容物中共分离出83株耐汞(25mg/L)菌株，经触酶试验、革兰氏染色、耐酸、耐胆盐试验共筛选出21株触酶试验阴性、耐强酸(pH=2)、耐高浓度胆盐(0.8％)的革兰氏阳性菌。
　　(2)经抑菌试验、药敏试验、体外抗氧化试验及汞离子吸附能力测定筛选出4株能够对五种致病菌标准菌株有抑制作用、对抗生素普遍敏感、有较优良体外抗氧化能力且在体外对汞离子吸附能力在90％以上的优势菌株。
　　(3)经分子生物学鉴定，四株菌株分别为两株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、一株嗜淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、一株约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。
　　(4)对4株乳酸菌进行汞及其他重金属MIC测定，结果显示菌株耐汞能力在50～58 mg/L，同时对硒、镉和镍都有不同程度的耐受能力。
　　(5)综合体外各项指标的结果，选出最优菌株23017进行抗性基因的筛选，结果显示抗性基因开放阅读框区域与乳酸菌水通道蛋白Aqy1基因相似度为96％～100％，证实为水通道蛋白Aqy1基因。
　　(6)测定小鼠的半数致死量为52.69mg/kg，建立急性汞中毒小鼠模型，采用筛选出的最优势菌株短乳杆菌23017进行益生菌缓解金属汞中毒的动物试验，有如下结果:
　　a.急性汞中毒可使小鼠体重大幅度减轻，短乳杆菌23017可以有效减缓体重下降;
　　b.通过病理切片显示短乳杆菌23017可有效缓解急性汞中毒引起的机体肝脏、肾脏以及肠道的损伤;
　　c.急性汞中毒后可以在肝脏、肾脏部位形成蓄积，部分可通过粪便排出体外，短乳杆菌23017可加速汞的排出，减少肝脏和肾脏的负担;
　　d.短乳杆菌23017可加速急性汞中毒后引起的体内氧化-抗氧化系统平衡的恢复;
　　e.短乳杆菌23017可使急性汞中毒引起的促炎、抑炎因子以及紧密结合蛋白的调控失衡得到缓解。
　　f.急性汞中毒可以使p38 MAPK通路和NF-κB通路激活，短乳杆菌23017可以调节相关细胞因子及蛋白表达以缓解炎性通路带来的损伤。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 汞的概述

1．2 汞的危害

1．2．1 对环境的影晌

1．2．2 对机体的危害

1．3 治疗汞中毒的方法

1．3．1 驱汞治疗法

1．3．2 血液透析治疗汞中毒

1．3．3 汞中毒疼痛治疗

1．3．4 现有疗法的弊端

1．4 微生物吸附重金属的研究进展

1．5 乳酸菌抗重金属机制的研究进展

1．5．1 乳酸菌对重金属的吸附与去除

1．5．2 乳酸菌缓解机体的氧化应激

1．5．3 乳酸菌对机体肠道黏膜免疫的调节作用

1．5．4 乳酸菌的益生作用

1．6 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验试剂与标准菌株菌种

2．1．2 试验动物

2．1．3 引物合成

2．1．4 试验仪器和设备

2．2 耐汞菌株分离鉴定和优势菌株的筛选

2．2．1 样品采集和耐汞菌株的分离

2．2．2 表型鉴定

2．2．3 稳定性和耐受性试验

2．3 体外益生特性的测定

2．3．1 耐酸、耐胆盐试验

2．3．2 抑菌试验

2．3．3 体外抗氧化能力测定

2．4 耐汞菌株药敏试验

2．5 耐汞菌株对汞离子的吸附能力测定

2．6 耐汞菌株分子生物学鉴定

2．7 分离菌株汞耐受性的测定

2．8 对多种重金属的抑制作用

2．9 抗性基因的筛选

2．10 动物试验

2．10．1 染汞剂量的确定

2．10．2 试验设计

2．11 检测指标

2．11．1 体重监测

2．11．3 汞含量检测

2．11．4 体内抗氧化指标检测

2．11．5 细胞因子表达检测

2．12 统计分析

3 结果

3．1．1 耐汞菌株表征

3．1．2 耐汞菌株稳定性检测

3．2 耐汞菌株的益生特性筛选

3．2．1 菌株耐酸、耐胆盐能力测定结果

3．2．2 抑制细菌能力测定结果

3．2．3 耐汞菌株药敏试验结果

3．3 分离菌株对汞的吸附能力测定结果

3．4 体外抗氧化试验结果

3．4．3 还原能力(抑制抗坏血酸自氧化能力)的测定结果

3．5 分离菌株的分子生物学鉴定结果

3．6 分离菌株的耐汞能力测定

3．7 分离菌株耐多种金属的MIC测定

3．8 抗性基因筛选结果

3．9 动物试验

3．9．1 体重的检测结果

3．9．2 病理学观察结果

3．9．3 体内残留汞含量的检测结果

3．9．4 各组织中抗氧化能力检测结果

3．9．5 细胞因子变化检测结果

3．9．6 P38 MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达检测结果

4 讨论

4．1 课题设计思路

4．2 乳酸菌的益生特性

4．3 乳酸菌对机体的保护作用

4．3．1 短乳杆菌23017缓解汞毒性导致的体重下降

4．3．2 短乳杆菌23017缓解汞毒性导致的病理损伤

4．3．3 短乳杆菌23017缓解汞毒性导致的氧化应激

4．3．4 短乳杆菌23017对细胞因子表达的调节

4．3．5 短乳杆菌23017对相关信号通路蛋白表达的调节

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文