姜黄素对肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中AFB1及其代谢物AFM1残留及消除的影响

摘要

黄曲霉毒素（Aflatoxins，简称AFT），是一组真菌次级代谢产物，其中的黄曲霉毒素B1(AFB1)广泛分布于发霉粮食及其制品中，毒性作用最大，被动物食用后在体内代谢会产生黄曲霉毒素M1(AFM1)，也具有极强的毒性，并且二者均会残留于动物的肝、肾、肌肉等人类可食用部分，直接威胁人类健康，所以建立一种高灵敏度的组织中黄曲霉毒素残留检测方法至关重要;姜黄素是中药姜黄的主要活性成分，有研究表明，姜黄素可以缓解黄曲霉毒素对动物机体的毒性作用，但是尚不明确其对AFB1和AFM1在组织中残留量有无影响。
　　目前黄曲霉毒素的残留检测方法有很多种，但是超高效液相色谱检测方法应用较少;超高效液相色谱方法(UHPLC)是高效液相色谱法(HPLC)技术的提升，二者相比，UHPLC的灵敏度和分离度都有了大幅度的提高，而且使检测时间大大的缩短，溶剂用量减少，检测成本降低，所以应用UPLC检测更具优势;因此，建立一种准确、灵敏、高效的超高效液相色谱法检测肉鸡可食用组织中的黄曲霉毒素残留，对保证畜禽产品的安全和人类的健康均具有重要的意义。
　　在本研究中，首先建立了能同时检测肉鸡肝脏，肾脏和肌肉组织中AFB1和AFM1残留的超高效液相色谱-荧光检测器(UHPLC-FLD)检测方法。方法对色谱条件和前处理条件进行了优化，选用C18(1.7μm×2.1 mm×50 mm)的Acquity UPLC BEH色谱柱，流动相选择乙腈∶水(2∶8)，流速为0.2 mL·min-1;进样量为10μL;柱温25℃;激发波长365 nm，发射波长435 nm;前处理提取溶液优选为二氯甲烷，净化选用AFM1免疫亲和柱，衍生选用三氟乙酸柱前衍生。方法学结果显示，肝、肾和肌肉组织添加三种不同浓度的AFB1和AFM1标准品，进行回收率试验，AFB1的平均回收率分别在82.32-85.56％，85.34-88.45％和84.88-89.73％之间，AFM1平均回收率分别为92.17-95.03％，94.12-97.21％和95.32-98.51％。AFB1和AFM1的检出限分别为0.008 ng·mL-1和0.003 ng·mL-1;定量限分别为0.02 ng·mL-1和0.01 ng·mL-1;建立的方法使AFB1和AFM1得到充分的提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高等优点;可以用于商业肉鸡加工公司，食品制造商和控制实验室的质量控制检测，以监测肉类的质量，确保食品安全。
　　其次，本试验对AFB1亚慢性中毒肉鸡体内AFB1和AFM1残留情况进行了分析，试验动物分为两组，模型组肉鸡采用黄曲霉毒素B1(5 mg·kg-1)连续攻毒28 d，姜黄素干预组肉鸡采用黄曲霉毒素B1（5 mg·kg-1）+姜黄素（300 mg·kg-1）饲喂28 d，停毒停药后采用标准饲料饲喂，分别在28、30、32、35、38和42 d剖杀肉鸡取材，应用建立的检测方法检测肝脏、肾脏和肌肉中AFB1和AFM1的残留量，检测结果表明，模型组被检测组织中AFB1残留量由高至低顺序依次是肌肉、肾脏和肝脏，同服姜黄素干预会使三种组织中AFB1残留量均增加;模型组待测组织中AFB1代谢物AFM1的残留量由高至低的顺序依次是肾脏、肝脏和肌肉，姜黄素干预会使三种组织中AFM1残留量均降低。
　　应用WT1.4软件根据不同取样时间的残留值进行残留消除时间的计算;由于没有组织中AFB1和AFM1标准的MRL，所以本试验分别拟用建立检测方法中的LOQ和LOD作为MRL对残留消除时间进行计算。结果表明，以AFB1的LOQ作为MRL进行计算，模型组肝脏、肾脏和肌肉组织中AFB1的残留消除时间分别为11、15和18d，姜黄素干预组肝脏、肾脏和肌肉组织中分别为17、19和17 d;以AFB1的LOD作为MRL进行计算，模型组肝脏、肾脏和肌肉组织中AFB1的残留消除时间分别为18、21和25 d，姜黄素干预组肝脏、肾脏和肌肉组织中分别为21、25和22 d;由于组织中AFM1的残留值低，仅28d的残留量高于LOQ，说明若以LOQ为MRL分析，AFM1的残留消除时间小于两天; AFM1以LOD作为MRL软件计算残留消除时间，模型组肝脏、肾脏和肌肉组织中AFM1的残留消除时间分别为30、30和29 d，姜黄素干预组肝脏、肾脏和肌肉组织中分别为29、26和26 d。
　　综上所述，本试验成功建立了同时检测肉鸡肝脏，肾脏和肌肉组织中AFB1和AFM1残留的超高效液相色谱-荧光检测器(UHPLC-FLD)检测方法，此方法灵敏度高，重现性好，准确度高，为AFB1和AFM1残留检测提供了新方法;通过AFB1亚慢性中毒模型组与姜黄素干预组肉鸡肝脏、肾脏和肌肉中AFB1和AFM1的残留检测，发现姜黄素能够改变AFB1和AFM1在肉鸡组织内的残留比例;通过分析得出肉鸡在发生AFB1亚慢性中毒时组织中AFB1和AFM1的残留消除时间，研究结果对保障食品安全及制订AFB1残留的有效防控措施具有重要的指导意义。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 黄曲霉毒素概述

1．1．1 黄曲霉毒素的发现

1．1．2 黄曲霉毒素的理化性质

1．1．3 黄曲霉毒素的危害

1．2 黄曲霉毒素B1的代谢

1．3 黄曲霉毒素的半数致死量、残留限量以及残留消除研究

1．3．1 半数致死量

1．3．2 残留限量

1．3．3 黄曲霉毒素残留消除的研究

1．4 黄曲霉毒素的前处理方法

1．4．1 黄曲霉毒素的提取

1．4．2 黄曲霉毒素的净化

1．5 黄曲霉毒素的检测方法

1．5．1 薄层色谱法

1．5．2 荧光光度法

1．5．3 酶联免疫吸附法

1．5．4 液相色谱法

1．5．5 液相色谱串联质谱法

1．5．6 其他方法

1．6 姜黄素研究进展

1．6．1 姜黄素的抗氧化作用

1．6．2 姜黄素的抗炎作用

1．6．3 姜黄素的抗肿瘤作用

1．6．4 姜黄素的其他作用

1．7 研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 试剂与药品

2．1．2 免疫亲和柱

2．1．3 试验动物

2．1．4 试验仪器

2．1．5 试剂的配制

2．2．1 前处理条件的优化

2．2．2 色谱条件优化

2．2．3 检测方法的确定

2．2．4 方法学考察

2．3 AFB1亚慢性中毒模型组及姜黄干预组肉鸡三种组织中AFB1及其代谢物AFMl的残留检测

2．3．1 饲料准备

2．3．2 动物分组及处理

2．3．3 前处理方法

2．3．4 检测条件

2．4 AFB1亚慢性中毒模型组及姜黄干预组肉鸡三种组织中AFB1及其代谢物AFM1的残留消除时间分析

2．5 数据处理与统计学分析

3 结果

3．1 前处理的优化

3．1．1 提取溶剂的选择

3．1．2 震荡时间的选择

3．1．3 亲和柱的选择

3．1．4 定溶液的选择

3．2 色谱条件的优化

3．2．1 流动相的选择

3．2．2 流速的选择

3．2．3 柱温的选择

3．2．4 检测波长的选择

3．3 样品提取与检测条件的确定

3．4 方法学考察结果

3．4．1 AFB1和AFM1色谱图

3．4．2 AFB1和AFM1的线性方程

3．4．3 AFB1和AFM1的保留时间及其变异系数

3．4．4 回收率和精密度

3．4．5 检测限与定量限

3．5．1 肝脏中AFB1和AFM1残留检测结果

3．5．2 肾脏中AFB1和AFM1残留检测结果

3．5．3 肌肉中AFB1和AFM1残留检测结果

3．6 模型组与干预组肉鸡肝脏、肾脏和肌肉中AFB1和AFM1残留消除时间(WT)分析

3．6．1 以LOQ为MRL计算的AFB1的残留消除时间(WT)

3．6．2 以LOD为MRL计算的AFB1的残留消除时间(WT)

3．6．3 以LOD为MRL计算的AFM1的残留消除时间(WT)

4 讨论

4．1．3 免疫亲和柱

4．1．4 衍生化以及定溶液

4．2 色谱条件的选择

4．3 方法学考察

4．4 模型组与干预组组织残留情况分析

4．5 消除分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文