猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

摘要

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。PPV的流行范围非常广泛，在世界各地均有感染，给养猪业和畜牧业造成了巨大的经济损失。VP2蛋白是PPV的结构蛋白之一，也是构成该病毒的主要衣壳蛋白，其携带了主要的抗原决定簇，决定着病毒的组织嗜性、抗原性、致病性等多种主要的生物学特性。
　　本研究将实验室保存的重组杆状病毒AcNPV-VP2同步接种于昆虫细胞Sf9，36h后收集病毒，并进行SDS-PAGE电泳，随后利用Western blot对其结果进行分析，结果显示蛋白成功的获得了高效表达。通过Ni柱树脂纯化，以及切胶纯化等方法，将表达的VP2蛋白进行纯化，并利用抗His标签蛋白单抗作为一抗，对纯化后的蛋白进行Western blot分析，结果表明，纯化效果良好，蛋白可用于后续的研究。
　　将纯化后得到的VP2蛋白作为免疫原，采用皮下注射的方式免疫6周龄的BALB/c小鼠，经过三次基础免疫和一次加强免疫后，利用细胞融合技术，将脾细胞与杂交瘤细胞进行融合。之后用间接ELISA方法进行筛选，经过3次以上细胞亚克隆，最终成功获得了1B3、2E5、5F8三株能够稳定分泌的抗VP2蛋白抗体的杂交瘤细胞。经鉴定，3株杂交瘤细胞的亚型均为IgG1型;杂交瘤细胞培养上清效价为1∶800-1000，将杂交瘤细胞按适当的量腹腔注射已经注射石蜡一周的BALB/c小鼠，检测获得的腹水效价为1∶32000-64000。
　　为进一步鉴定3株单克隆抗体的免疫反应性，收集同步接种猪细小病毒后的ST细胞，并以此为检测用免疫原，检测单克隆抗体的免疫原性。对其及进行了Western blot检测，结果表明3株单抗均可以对PPV全病毒以及重组VP2蛋白特异性识别;间接免疫荧光结果表明，3株单抗均产生荧光，可以与PPV全病毒发生反应;特异性试验表明，3株单抗均不与TEGV和PEDV等病毒发生反应，仅特异性与PPV发生反应;将在体外连续传代3个月和冻存后再复苏的3株杂交瘤细胞做了稳定性分析，结果表明，3株单抗的稳定性较好。
　　本研究成功筛选了3株具有较高的反应原性和特异性的猪细小病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体，为后期建立有效的PPV特异性血清学检测方法奠定了理论依据，同时也为PPV受体及感染机制的研究提供了物质基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪细小病毒概述

1．1．1 猪细小病毒的病原学

1．1．2 猪细小病毒基因组结构

1．1．3 猪细小病毒编码的蛋白

1．1．4 PPV的培养特性

1．1．5 PPV的流行病学

1．2 猪细小病毒的诊断

1．2．1 病毒的分离和鉴定

1．2．2 PCR检测技术

1．2．3 中和试验(SN)

1．2．4 凝集试验

1．2．5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

1．2．6 免疫荧光技术

1．3 PPV疫苗研究进展

1．3．1 弱毒疫苗

1．3．2 灭活疫苗

1．3．3 基因疫苗

1．4 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 细胞、病毒与抗体

2．1．2 实验动物

2．1．3 培养基和主要试剂

2．1．4 主要实验仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 VP2蛋白的表达与鉴定

2．2．2 VP2蛋白的纯化

2．2．3 单克隆抗体制备

2．2．4 单克隆抗体生物学特性的鉴定

3 结果与分析

3．1 VP2蛋白的表达及鉴定

3．1．2 VP2蛋白的Western blot鉴定

3．2 VP2蛋白的纯化

3．3 间接ELISA检测方法的建立

3．4 杂交瘤细胞的亚克隆

3．5 单抗效价测定

3．6 单抗亚类的鉴定

3．7 单克隆抗体特异性鉴定

3．8 单克隆抗体Western blot鉴定

3．9 间接免疫荧光鉴定

3．10 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性

4 讨论

4．1 VP2蛋白的表达和纯化

4．2 单抗制备过程免疫原的选择

4．3 单克隆技术的重要环节

4．4 制备PPV VP2蛋白单克隆抗体潜在的应用价值

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文