一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建pET30a‑PPV6‑VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni‑NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)2SO4盐析方法纯化抗体。制备的兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪细小病毒6型VP2蛋白抗体外的其他猪常见病原抗体。以上特征充分满足了外源病毒检验用阳性血清的要求，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，是一种自主复制型病毒，是造成母猪繁殖障碍性疫病的主要病原体之一；母猪感染该病毒后可导致流产、木乃伊胎及死胎等，其给国内外养猪业造成了严重的经济损失；Mary与Mahncl在1966年首次发现了该病毒，而后发展到世界多个国家和地区；在20世纪80年代，我国的多个地方都分离发现猪细小病毒病。目前，随着分子生物学诊断技术的发展，PPV2、PPV3、 PPV4、PPV5和PPV6等几个新型猪细小病毒已被发现，这几个新型的PPV在基因组方面，尤其是在VP2基因方面存在较大差异性。2014年Ni等利用序列无关单引物扩增 (SISPA)的方法，在中国的流产猪胎儿中发现了一种新型的细小病毒，命名为Porcine parvovirus type6，即PPV6。

PPV为单股线状DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，基因组全长约为5kb，含有2个主要的开放阅读框(ORF)，其中ORF1编码3个非结构蛋白NS1、NS2、NS3； ORF2编码2个结构蛋白VP1、VP2，VP2可进一步水解为VP3。PPV6与其他细小病毒亚族成员基因序列同源性为20.5％-42.6％，与PPV4的关系最亲密。PPV6基因组全长约为6136bp，G+C含量为46.7-47.1％，其基因组结构与传统细小病毒相似，ORF1编码由 622个氨基酸构成NS蛋白，ORF2编码由1189个氨基酸构成VP蛋白。VP蛋白大小约为132kD，大于绝大多数细小病毒。组成核衣壳的主要结构蛋白是VP2，其分子大小约为64kD，由579个氨基酸构成，VP2具有良好的抗原性，在病毒的致病性方面起着重要重要，并且可以诱导动物机体产生保护性免疫反应。

目前有学者采用真核表达系统、杆状病毒系统等对VP2蛋白进行诱导表达，但其蛋白表达量较低，且不便于培养。大肠埃希菌表达载体作为非常成熟的表达载体，其拥有得天独厚的技术优势。单克隆抗体只有一个克隆位点，其只能识别某一特定的抗原表位，具有较高的特异性和灵敏度。多克隆抗体作为重要的免疫诊断材料，其与单克隆抗体相比具有独特的优势，能识别多个抗原表位，即使少数几个抗原表位被破坏或抗原构象改变，实验结果也不受影响；且制备方法较便、成本较低。

发明内容

针对上述背景技术中指出的不足，本发明根据PPV6流行毒株(GenBank：KX384821.1、MH820262.1、MH447540.1和MK378402.1)基因组序列设计2条特异性引物，提供了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。

本发明采用以下技术方案：

一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)免疫原制备

根据PPV6流行毒株(GenBank：KX384821.1、MH820262.1、MH447540.1和MK378402.1)基因组序列设计2条特异性引物(P1和P2)，对采集于辖区及周边区域的母猪流产胎儿样品进行PCR鉴定；以PCR扩增片段为目的序列，构建 pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，并对阳性重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定；阳性克隆菌于37℃、1mmol/LIPTG诱导表达6h，表达菌液超声破碎，12000r/min离心收集上清裂解液，Ni-NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，SDS-PAGE分析， Westernblot鉴定；纯化后复性VP2蛋白与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2 蛋白免疫原。

(2)高免血清制备

以纯化后复性VP2蛋白为免疫原，背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，首次使用弗氏完全佐剂乳化的VP2蛋白免疫原，免疫剂量为200μg/只；首免后14d、28d和42d改用弗氏不完全佐剂乳化的VP2蛋白免疫原，进行加强免疫，免疫剂量均为400μg/只；第四次免疫后7d(即首免后49d)颈动脉放血，4000r/min离心分离血清，收集抗体效价≥1:2 5600的高免血清，备用。

(3)抗体纯化、脱盐、浓缩

饱和(NH4)

S1、采用生理盐水稀释高免兔血清，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH4)

S2、向步骤S1得到的上清溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH

S3、向步骤S2所得沉淀中加入生理盐水溶解，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH

S4、重复步骤S3三次；

S5、向步骤S2所得沉淀中加入PBS溶解，4000r/min超滤浓缩30min脱盐。

S6、取3～4mL超滤透析液，滴加1～2滴纳氏试剂，检测超滤透析液中是否存在NH

(4)抗体鉴定、过滤除菌及分装。

采用SDS-PAGE、Westernblot和IFA对纯化后抗体进行鉴定，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-40℃保存。

其中所述PCR扩增片段大小为981bp。

所述重组VP2蛋白大小为40kD，该蛋白与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙脑病毒阳性血清不发生交叉反应。

所述免疫佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，检测抗体效价是指采用间接ELISA方法检测免疫兔血清的抗体效价。

所述试验动物为20日龄、健康、体重相似的新西兰大耳白兔。

本发明公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，由发明人根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建 pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni-NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)

附图说明

图1是本发明实施例提供的PPV6VP2基因PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000 分子量Marker，1，2：阴性ddH

图2是本发明实施例提供的pET30a-PPV6-VP2重组质粒PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1-3：pET30a-PPV6-VP2重组质粒PCR扩增产物；4：阴性 ddH

图3是本发明实施例提供的pET30a-PPV6-VP2重组质粒双酶切鉴定的结果图，图中， M1：DL2000分子量Marker；1：pET30a(+)空载体；2：pET30a-PPV6-VP2重组质粒； M2：DL10000分子量Marker。

图4是本发明实施例提供的PPV6 VP2蛋白诱导表达、纯化的SDS-PAGE分析结果图，图中，M：蛋白质marker；1：pET30a(+)空载体；2：诱导前重组菌；3：诱导后重组菌；4：诱导后重组菌裂解沉淀；5：纯化后复性的重组VP2蛋白。

图5是本发明实施例提供的PPV6 VP2蛋白的Western blot分析结果图，图中，1：pET30a(+)空载体对照；2：重组VP2蛋白。

图6是本发明实施例提供的兔源抗PPV6 VP2抗体纯化的SDS-PAGE分析结果图，图中，M：蛋白Marker，1，2：PPV6 VP2抗体；3：未免疫兔血清阴性对照。

图7是本发明实施例提供的兔源抗PPV6 VP2抗体IFA分析结果图，图中，图7A为未免疫兔血清阴性对照，图7B为PPV6 VP2抗体。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

一、材料与方法

1、材料

美洲型-猪繁殖与呼吸综合征病毒(NA-Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，NA-PRRSV)阳性血清、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2) 阳性血清购自VMRD公司；猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)阳性血清、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)阳性血清均由开江县动物疫病预防控制中心制备并保存。

临床样品为50份母猪流产胎儿，采自2017-2020年中国西南地区的4个省份不同猪场，-40℃保存。

小剂量核酸提取试剂盒购自宝生生物工程(大连)有限公司；pET30a(+)载体购自Novagen公司；PCR扩增试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司；质粒提取试剂盒购自AxyPrep公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG购自SIGMA公司；Ni-NTA树脂购自QIAGEN公司。

2、方法

(1)引物设计与合成

利用Megalign软件将Gen Bank中已登录的PPV6流行毒株基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，运用的Primer Premier 6.0软件，根据GenBank中已登录的PPV6(登录号：KX384821.1、MH820262.1、MH447540.1和MK378402.1)高度保守基因序列设计特异性引物P1和P2，扩增目的片段大小预期为981bp，所述引物的基因序列如下：

P1：5'-CA

P2：5'-GC

引物委托成都擎科生物科技有限责任公司合成。

(2)样品处理及核酸提取

按照核酸提取试剂盒对50份流产胎儿样品进行DNA提取。

(3)PCR扩增

以P1、P2为引物，流产胎儿样品核酸为模板，目的片段大小为981bp，反应体系为：Ex-Taq酶25μL，上、下游引物各1μL，模板2.5μL，补水至50μL。反应程序为： 94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。取10μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并采用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段， -20℃保存。

(4)pET30a-PPV6-VP2重组表达载体构建及鉴定

采用BamHI和XhoI分别对pET30a(+)载体和DNA凝胶回收产物进行酶切反应，反应体系为：PCR胶回收产物或pET30a(+)载体20μL，10×K Buffer 3μL，BamH I 2μL， Xho I 2μL，ddH2O 3μL，总体体积为30μL。振荡混匀，先放入30℃水浴3h，再37℃水浴3h。酶切产物经T4连接酶16℃连接过夜，取连接产物转化于BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性的LA平板，37℃培养12h，挑取单菌落过夜培养， 12000r/min离心收菌，提取质粒，对质粒进行PCR、双酶切鉴定，反应产物于1％琼脂糖凝胶电泳，同时将阳性重组质粒送往成都擎科生物科技有限责任公司进行测序。

(5)重组VP2蛋白诱导表达、纯化、浓缩及鉴定

将阳性克隆菌于37℃振荡培养约3h，至OD

(6)高免血清制备

按照免疫剂量，将纯化后复性VP2蛋白与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备免疫原，背部皮下多点注射20日龄、健康、体重相似的新西兰大耳白兔，首次使用弗氏完全佐剂乳化的VP2蛋白免疫原，免疫剂量为200μg/只；首免后14d、28d和42d改用弗氏不完全佐剂乳化的VP2蛋白免疫原，进行第二次、第三次和第四次免疫，免疫剂量均为400μg/ 只；每次免疫前耳缘静脉采血1mL，第四次免疫后7d(即首免后49d)颈动脉放血，分离血清，采用间接ELISA方法测定免疫血清中VP2蛋白特异抗体效价，收集抗体效价为 1:25600以上高免血清，用于VP2蛋白抗体的制备。

免疫兔血清间接ELISA方法如下：ELISA法检测各组免疫后0、14、28、42和49d 的兔血清效价。将抗原以100μL/孔包被于96孔ELISA反应板，4℃过夜；PBST洗板3 次，以5％脱脂奶粉37℃封闭1h；PBST洗板3次，加入倍比稀释的兔血清(1：200、1： 400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600)，100μL/孔，同时以未免疫兔血清为阴性对照，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1：6000稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入100μL TMB 底物显色液，室温避光孵育20min；50μL 1.5moL/L H

(7)抗体纯化、脱盐

饱和(NH4)

S1、采用生理盐水稀释高免兔血清，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH4)

S2、向步骤S1得到的上清溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH

S3、向步骤S2所得沉淀中加入生理盐水溶解，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH

S4、重复步骤S3三次；

S5、向步骤S2所得沉淀中加入PBS溶解，4 000r/min超滤浓缩30min脱盐。

S6、取3～4mL超滤透析液，滴加1～2滴纳氏试剂，检测超滤透析液中是否存在NH

(8)抗体鉴定、过滤除菌及分装。

采用SDS-PAGE和Western blot(反应条件见步骤5)对纯化后抗体进行鉴定。同时将实验室分离鉴定的PPV6毒株接种于长成70％单层的PK-15细胞中，37℃温箱培养48 h；4％多聚甲醛4℃固定细胞30min；PBS洗涤3次，每次5min，以5％脱脂奶粉37℃封闭1h；以制备的抗重组VP2蛋白抗体和未免疫兔血清(3％BSA 1：100稀释)为一抗， FITC标记的羊抗兔IgG(PBST 1：300稀释)为二抗，37℃孵育，PBST洗涤，进行间接免疫荧光(IFA)鉴定。最后将制备的抗体经0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-40℃保存。

二、结果与分析

1、PCR扩增及pET30a-PPV6-VP2重组表达载体构建结果

以P1、P2为引物，流产胎儿样品核酸为模板，扩增得到大小为981bp的目的片段，如序列1所示，结果如图1所示。对pET30a-PPV6-VP2重组表达载体进行PCR、双酶切鉴定发现，在981bp处均出现目的片段，结果如图2、3所示。经测序，测序结果与NCBI 公布的登录号KX384821.1、MH820262.1、MH447540.1和MK378402.1同源性为100％，说明构建的pET30a-PPV6-VP2重组质粒正确。

2、重组VP2蛋白表达及鉴定结果

表达的重组蛋白经12％SDS-PAGE分析，以包涵体形式存在，相对分子质量约40kD，大小与理论值相符，纯化后的重组蛋白具有较高纯度，产量可达4.1mg/mL，结果如图4 所示。重组VP2蛋白与PPV6阳性猪血清发生特异性反应，而pET30a空载体无特异性条带，结果如图5所示，表明重组VP2蛋白具有良好的反应原性。

3、免疫兔血清抗体效价

间接ELISA检测结果表明，首免后14d，重组VP2蛋白的血清抗体效价为1：400；首免后28d，抗体效价为1：6400；首免后42d，抗体效价为1：25600；首免后49d，抗体效价为1：25600，结果如表1所示。

表1免疫兔血清抗体效价

4、免疫兔血清SDS-PAGE及Western blot分析结果

SDS-PAGE分析发现，在40kD处出现目的条带，结果如图6所示；纯化后免疫兔血清与重组VP2蛋白发生特异性反应，而阴性对照兔血清无特异性条带，结果如图6中3 所示，表明纯化后兔源抗PPV6 VP2抗体具有良好的特异性。

5、兔源抗PPV6 VP2抗体IFA分析结果

制备的兔源抗PPV6 VP2抗体能与PPV6全病毒发生特异反应，而阴性对照兔血清无荧光信号，结果如图7所示。

本发明公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，由发明人根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建 pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni-NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)

序列表

<110> 开江县动物疫病预防控制中心

<120> 一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法

<130> 20210419

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccagac cccttggtgc tattatgatc tgaacgtcat ctcagcacat ttttctcctt 60

ctgcttggca gaggcttttg gaggattatg atgcctttcg acctaaatcc cttaaagtta 120

ccatccagtc tttagttttt aaagatgtct gtcaaggtgc agaaaaacaa actacagttc 180

acgattccca gtcagccacc attgctatct ttgaggataa agactatgac tacccctatg 240

tgatgggagg gggtcaaaaa acagttccgg gtcacttgcc cggtcaacct tataatcttc 300

ccaagtattc ttacagaacc cttggttcag tcaaagaaag taatagggcc agtatgggcg 360

gttcagggta cactttcaaa tccaatcaag atacggaatt gtttctgctt gaaacacatg 420

atgccactct tattcgaggc gggggtactt ttgagcagta ctatgaattt ccaaacgatc 480

ttcctttcga aaatttgact cagtatcctt gggatatccg ccgtcaggat aacccccttt 540

atcagcagag gatcactgtc atgtcaggtt ctgacagaga tacggtaggc attctagatg 600

gagattttta ctctcctttt cggttcaaag gtcatgatag acccgccatg tggctgccag 660

gacagaggtt gattcagggc aaattcatag atacgcaccc aatacccaat acagggagga 720

gtggggttca tcctaatgat tttcacacaa ggggcgatgg tcatggtgac acccatagaa 780

cacatgaaga gaggatctac agtctagata caggtcttgc tgctatgcca cgtgccgctc 840

atagacccac ccttcagccc ggacctagga ctctgtctca tgccgtacgc agacccgatg 900

gttccaccgt ggtcacggct aatgcgtgtg cttacgctta cacccaggag aatcctcatc 960

aggaaccctg gagtgctcga g 981