HRS干预腹腔镜小型猪肝脏缺血再灌注合并肝损伤肝脏再生的研究

摘要

肝部分切除术是肝脏移植和肝脏肿瘤治疗的经典方法。而肝脏强大的再生功能是肝部分切除术后肝功能恢复的保证。腹腔镜手术微创、术野清晰、对机体刺激小的优势使腹腔镜手术的应用和推广也越来越越广泛。为探讨腹腔镜手术的安全性、可行性以及对疾病的治疗效果，以腹腔镜技术构建动物模型的研究也越来越受到关注，本试验室已经成功利用腹腔镜技术构建小型猪消化道瘘管动物模型、小型猪肾衰模型，小型猪肝损伤模型等多个动物模型，为临床研究和比较医学提供大量的科研依据。本试验在小型猪肝损伤模型的基础上，通过门静脉注入HRS，通过对相关指标的检测，综合评价HRS对肝损伤后再生的影响。
　　本研究选取24头小型猪，随机分为三组，每组8头，分别为假手术组（A组）、模型组（B组）、HRS干预组（C组）。A组仅建立气腹和手术通路，翻动肝叶，不做其他手术操作;B组进行腹腔镜右半肝缺血60min合并左半肝切除术;C组行门静脉插管于再灌注前10min注入HRS，其余操作同B组。试验通过建立气腹、选定手术通路、分离胆囊管和胆囊动脉、右半肝缺血60 min同时行门静脉插管、于再灌注10min前按10ml/kg注射HRS，缺血60min后贯穿结扎肝实质进行腹腔镜左半肝切除、冲洗腹腔、取出离断的的肝实质、缝合腹腔等步骤完成腹腔镜手术。于术后1d、2d、3d继续按10ml/kg注入HRS。并于术前、术后1d、2d、3d、5d、7d采取血液样本，检测指标包括:相应试剂盒检测肝功能(LDH、ALP、TP)，ELISA检测透明质酸(HA)及血管生成因子（VEGF、Ang-1、Ang-2）血清浓度变化。于术前、术后1d、5d、7d采取肝组织样本，分别用于HE染色进行组织病理学观察、PCNA免疫组织化学观察、实时荧光定量PCR检测肝再生相关因子(HGF、Cyclin-D1、TGF-β1)基因表达量变化。
　　试验结果表明，三组腹腔镜手术操作顺利完成，术后恢复良好。缺血再灌注合并肝部分切除损伤后肝功能指标变化表现为，血清ALP、LDH、TP在术后1d、2d变化最为明显差异极显著（P＜0.01），B组术后血清ALP、LDH高于C组，血清ALP在术后1d、2d差异显著（0.01＜P＜0.05），血清LDH在术后1d差异极显著(P＜0.01)，血清TP变化B组与C组之间差异不显著，说明HRS有利于术后肝脏功能恢复。术后血清HA浓度呈先升高后降低的趋势且在术后1d达到最大值差异极显著(P＜0.01)，同时间点B组术后血清HA浓度高于C组并且在术后1d、2d、3d均表现为差异极显著（P＜0.01），说明HRS能够减轻肝窦内皮细胞损伤，使HA代谢能力提高。损伤后的肝脏在术后1d细胞凋亡、坏死、炎性浸润最为严重，在术后7d逐渐恢复，C组在术后7d组织结构更为清晰完整，接近正常组织，极少量炎性细胞浸润，而B组仍有较多炎性细胞浸润，说明HRS利于术后肝组织结构的恢复。术后血清血管生成因子(VEGF、Ang-1、Ang-2)浓度变化呈先升高后降低的趋势且B组低于C组，血清VEGF、Ang-1在术后3d差异极显著(P＜0.01)，血清Ang-2在术后3d、5d差异极显著(P＜0.01)，说明HRS能够上调术后VEGF、Ang-1、Ang-2浓度。术后肝细胞PCNA表达水平在术后1d达到最大且C组明显高于B组差异极显著(P＜0.01)，在术后3d仍高于B组差异显著(0.01＜P＜0.05)，说明HRS能够促进术后PCNA的表达。损伤后的肝组织HGF、Cyclin-D1基因表达量在术后1d达到最大值差异极显著(P＜0.01)且C组高于B组差异极显著（P＜0.01），TGF-β1表达量在术后3d达到最大值差异极显著(P＜0.01)且C组明显低于B组差异极显著（P＜0.01），说明上调肝再生促进基因(HGF、Cyclin-D1)表达，下调肝再生抑制基因TGF-β1的表达。
　　以上试验结果表明:
　　(1)HRS有利于肝缺血再灌注合并肝部分切除后肝组织结构的恢复，减轻炎性细胞浸润，减轻肝窦内皮细胞损伤程度，改善肝脏环境，能够有效地促进肝脏功能恢复。
　　(2)HRS能够上调肝缺血再灌注合并肝部分切除后血清中血管生成因子(VEGF、Ang-1、Ang-2)浓度，说明HRS对VEGF、Ang-1、Ang-2的分泌调节起到促进作用。
　　(3)HRS促进肝缺血再灌注合并肝部分切除后直接有丝分裂原HGF、Cyclin-D1、PCNA表达量增加，降低肝再生抑制基因TGF-β1的表达。说明HRS对肝脏再生具有一定的调节促进作用。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 腹腔镜外科的介绍

1．1．1 腹腔镜外科发展简介

1．1．2 腹腔镜外科的技术特点

1．1．3 腹腔镜外科的发展趋势

1．2 兽医临床中腹腔镜技术的应用概述

1．2．1 在牛的应用

1．2．2 在马的应用

1．2．3 在羊的应用

1．2．4 在犬猫的应用

1．3 肝再生概述

1．3．1 肝部分切除术与肝再生的调节

1．3．2 肝再生动物模型的研究进展

1．4 小型猪肝脏再生模型的应用

1．5 HRS对肝损伤的保护作用

1．6 目的与意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物及分组

2．1．2 试验器材

2．1．3 药品与试剂

2．2 方法

2．2．1 HRS的制备与浓度测定

2．2．2 术前准备

2．2．3 麻醉与保定

2．2．4 手术操作

2．2．5 术后护理

2．2．6 标本和样品采集

2．2．7 检测指标

2．2．8 数据统计分析

3 结果

3．1 手术完成情况

3．2 术后肝功能检测结果

3．2．1 碱性磷酸酶(ALP)

3．2．2 乳酸脱氢酶(LDH)

3．2．3 总蛋白(TP)

3．3 术后血清透明质酸(HA)检测结果

3．4 肝组织病理学变化

3．5 术后血清血管生长因子

3．5．1 血管内皮生长因子(VEGF)

3．5．2 血管生成素-1(Ang-1)

3．5．3 血管生成素-2(Ang-2)

3．6 增殖细胞核抗原(PCNA)的表达

3．7 肝再生相关因子的表达

3．7．1 肝细胞生长因子(HGF)

3．7．2 细胞周期素D1(Cyclin-D1)

3．7．3 转化生长因子-β1(TGF-β1)

4 讨论

4．1 HRS对术后肝脏功能及肝组织结构的影响

4．2 HRS对透明质酸水平的影响

4．3 HRS对血清中血管生成因子的影响

4．4 HRS对肝脏再生相关因子的调节

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文