副干酪乳杆菌对糖尿病的改善作用及其机制研究

摘要

近年来，糖尿病患病人数呈逐年增长趋势。据国际糖尿病联盟预测，2045年全球糖尿病患病人数将高达6.29亿。而目前临床上治疗糖尿病的药物通常会引起一些副作用，严重降低人们的生活质量。因此，开发研制一种天然、无副作用的新型降糖药物或辅助治疗药物变得至关重要。乳酸菌因其价格低廉、易获得和安全等特点，逐渐成为糖尿病防治的研究热点。研究证实，乳酸菌或其发酵食品均对糖尿病起到一定的改善作用，但由于其机制尚不明确，因此还需对乳酸菌的降糖机制进行更深入的研究。
　　本课题通过对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷体外筛选方法对实验室保存的8株分离自西藏地区发酵乳制品中的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）进行体外降血糖能力的评价，筛选出降血糖能力最强的L.paracasei TD062作为研究对象。然后利用模拟胃肠道环境的方法测定L.paracasei TD062对酸、胆盐和人工胃肠液的耐受性，评估其体内存活的能力。其次构建动物模型，通过体内实验评价L.paracasei TD062对糖尿病小鼠的改善作用。最后利用real-time RT-PCR技术对其降糖机制进行探究。
　　通过上述研究得到如下结果:
　　1、利用体外筛选方法对8株L.paracasei的α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果进行评估，发现8株菌株对α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用。其中，L.paracasei TD062的α-葡萄糖苷酶抑制率最高，为31.89％，表现出最强的体外降血糖能力。因此本课题选取L.paracasei TD062作为后续研究对象。
　　2、L.paracasei TD062在pH3.0的条件下培养3h后，菌株的存活率达到91.08％，活菌数为7.45log cfu/mL;在含0.3％的胆盐培养基中培养4h后，菌株的存活率达到85.45％，活菌数为6.99log cfu/mL;在人工模拟胃液、肠液中培养后，菌株的存活率分别为89.98％和79.95％，活菌数分别为7.36log cfu/mL和6.54log cfu/mL，降低了2个数量级。由结果可知，L.paracasei TD062具有良好的耐酸、耐胆盐以及耐人工胃肠液的能力。
　　3、利用高脂高糖饮食和小剂量链脲佐菌素构建糖尿病模型，对菌株的体内降血糖能力进行评估。在经过13周的实验后，发现L.paracasei TD062可有效降低糖尿病小鼠的餐前餐后血糖、脏器指数、糖基化血红蛋白以及胰岛素等基础指标的水平，同时能够有效抑制体重的降低，提高葡萄糖耐受性，并可显著改善血脂紊乱、氧化应激和炎症反应水平。
　　4、提取小鼠的肝脏总RNA，利用real-time RT-PCR技术检测胰岛素信号传导通路和糖代谢过程中关键基因的表达水平变化。经L.paracasei TD062作用后，糖尿病小鼠中PEPCK、G-6-Pase和GSK-3β基因表达量呈现不同的下调趋势，与模型组相比差异显著(P＜0.05)。同时该菌株显著上调IRS-2、PI3K和Akt的基因表达量，且在一定程度上呈现剂量依赖性。结果表明L.paracasei TD062的降糖机制可能是通过激活PI3K/Akt信号通路，调控下游因子的表达，提高机体对胰岛素的敏感性，调节糖代谢水平，从而达到降低血糖的目的。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 糖尿病与人体健康

1．1．1 糖尿病简介

1．1．2 糖尿病症状及其危害

1．1．3 糖尿病的影响因素

1．1．4 糖尿病的治疗方法

1．1．5 糖尿病动物模型

1．2 乳酸菌简介

1．3 乳酸菌降血糖机理研究

1．3．1 乳酸菌对脂质代谢紊乱的影响

1．3．2 乳酸菌对氧化应激的影响

1．3．3 乳酸菌对免疫反应的影响

1．3．4 乳酸菌对信号通路的影响

1．3．5 乳酸菌对肠道菌群的影响

1．4 研究目的与意义

1．5 研究内容

2 材料与方法

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验动物及菌株

2．1．2 生化试剂

2．1．3 设备与仪器

2．1．4 溶液的配制

2．2 体外降血糖菌株的筛选

2．2．1 菌株的活化与保藏

2．2．2 无细胞上清液的制备

2．2．3 降血糖菌株的筛选

2．3 菌株鉴定及生长特性

2．3．1 革兰氏染色

2．3．2 16S rDNA序列鉴定

2．3．3 菌株生长特性

2．4 环境耐受性实验

2．4．1 耐酸性实验

2．4．2 耐胆盐实验

2．4．3 耐人工胃肠液实验

2．5 菌株降血糖功能的体内研究

2．5．1 实验动物分组及糖尿病模型的建立

2．5．2 体重测定

2．5．3 血糖及口服糖耐量测定

2．5．4 小鼠的处死及相关样品的收集

2．5．5 糖尿病中HbA1c和胰岛素含量的测定

2．5．6 血脂水平测定

2．5．7 肝脏中指标的测定

2．5．8 炎症因子水平测定

2．6 降血糖信号通路的研究

2．6．1 小鼠肝脏组织RNA的提取

2．6．2 RNA完整度和纯度的检测

2．6．3 反转录反应体系

2．6．4 Real-time RT-PCR检测降血糖相关基因的表达量

2．7 统计分析

3 结果与分析

3．1 体外降血糖菌株的筛选

3．2 菌株鉴定及生长特性

3．2．1 L．paracasei TD062菌株镜检

3．2．2 L．paracasei TD062的16S rDNA序列测定

3．2．3 L．paracasei TD062的生长特性

3．3 环境耐受性

3．3．1 L．paracasei TD062的耐酸性实验

3．3．2 L．paracasei TD062的耐胆盐实验

3．3．3 L．paracasei TD062的耐人工胃肠液实验

3．4 降血糖功能的体内研究

3．4．1 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠体重的影响

3．4．2 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠血糖及口服糖耐量的影响

3．4．3 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠脏器指数的影响

3．4．4 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠中HbA1c和胰岛素含量的影响

3．4．5 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠血脂水平的影响

3．4．6 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠肝脏中指标的影晌

3．4．7 L．paracasei TD062对糖尿病小鼠炎症因子水平的影响

3．5 降血糖信号通路的研究

3．5．1 RNA完整性和纯度的检测

3．5．2 L．paracasei TD062对降血糖相关基因表达量的影响

4 讨论

4．1 降血糖菌株的筛选

4．2 环境耐受性评价

4．3 体内降血糖功能评价

4．3．1 菌株对糖尿病相关指标的影响

4．3．2 菌株对血脂水平的影响

4．3．3 菌株对氧化应激的影响

4．3．4 菌株对免疫水平的影响

4．4 降血糖相关基因

4．4．1 关于糖代谢相关基因

4．4．2 关于胰岛素信号传导通路相关基因

4．5 降血糖调控机制相关通路分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文