大果沙棘黄酮分离纯化及生物活性研究

摘要

大果沙棘(Hippophae rhamnoides var.sp),为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae Linn.)。大果沙棘果中含有大量的生物活性物质,包括黄酮、多酚、胡萝卜素、有机酸、脂类等,其主要活性成分沙棘黄酮具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、保肝、抑菌、保护心血管系统等多项生理功能。
　　 本文以大果沙棘果渣黄酮为研究对象,系统地研究了其分离提取工艺以及生物活性。采用酶辅助法对大果沙棘果渣中的黄酮进行提取,确定了最佳提取工艺条件,获得大果沙棘黄酮提取物。对大果沙棘黄酮的分离纯化进行研究,优化大孔吸附树脂吸附分离大果沙棘黄酮的工艺条件。采用多种方法研究了大果沙棘黄酮的抗氧化活性,并对其抗疲劳、降血脂和抗肿瘤活性及其相关作用机理进行研究。本研究的主要内容如下:
　　 1、对大果沙棘果渣中化学成分进行分析,测定了其中的水分、灰分、总蛋白、粗脂肪、多糖、黄酮、多酚等主要化学成分的含量。
　　 2、采用酶辅助法对大果沙棘果渣中黄酮的提取工艺进行研究,利用单因素试验和响应面试验优化大果沙棘黄酮的提取工艺,确定最佳提取工艺条件为:纤维素酶用量0.85mg/mL,酶解温度50.9℃,pH值5.1,酶解时间2h,提取温度50℃,液固比值20,乙醇体积分数71.4％,提取时间2h,大果沙棘果渣黄酮的得率为8.98mg/g。
　　 3、对大果沙棘黄酮的分离纯化条件进行研究,考察了七种不同大孔树脂对大果沙棘黄酮静态和动态吸附及解吸效果,X-5大孔吸附树脂对大果沙棘黄酮吸附分离效果最好。并通过X-5大孔树脂柱研究了上样浓度、pH值、洗脱剂浓度、洗脱体积对黄酮回收率的影响。X-5树脂柱吸附分离大果沙棘黄酮的最佳条件为:大果沙棘提取液上样浓度为2mg/ml,吸附时间2h,用4BV蒸馏水洗脱除去杂质,然后用4BV70％乙醇洗脱,黄酮回收率为86.78％,纯度为54.1％。
　　 4、系统地研究了大果沙棘粗提黄酮和纯化黄酮的体外抗氧化能力,考察了其总抗氧化能力和对超氧阴离子、羟基自由基、DPPH和ABTS自由基的清除能力。并与芦丁和儿茶素标准品进行对比,进而确定大果沙棘黄酮的抗氧化效果。
　　 5、以昆明小鼠为实验动物,研究大果沙棘黄酮及其与西洋参、红景天、二十八烷醇复合制剂的抗疲劳作用。通过小鼠爬杆实验和负重游泳实验,研究大果沙棘及其复合制剂对小鼠的运动能力和运动后体内血乳酸、尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响,研究大果沙棘复合制剂对小鼠的抗疲劳作用。
　　 6、研究了大果沙棘黄酮的体内降血脂功能。以Wistar大鼠为实验动物,建立大鼠高血脂症模型,考察了大果沙棘黄酮对高血脂大鼠的血脂水平、脂代谢相关酶活性和抗动脉硬化指数及体内抗氧化的影响,研究大果沙棘黄酮降血脂功能和抗动脉硬化作用。
　　 7、研究大果沙棘黄酮的体外抗肿瘤作用。选用人肝癌HepG2、人结肠癌HT29和人乳腺癌MCF-7三种肿瘤细胞株为研究对象。采用MTT比色法研究了不同浓度的大果沙棘黄酮对人肝癌HepG2、人结肠癌HT29和人乳腺癌MCF-7三种肿瘤细胞增值的抑制作用,比较对三种肿瘤细胞抑制效果。
　　 8、研究大果沙棘黄酮体外抗肿瘤作用机理。采用流式细胞仪检测大果沙棘黄酮对HepG2肿瘤细胞周期变化和细胞凋亡情况;采用单细胞凝胶电泳和DNA Ladder检测对肿瘤细胞DNA损伤的影响;并通过免疫组化法检测肿瘤细胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达和通过测定细胞Caspase-3酶活力研究对大果沙棘黄酮对肿瘤细胞抑制作用分子机制。研究结果发现大果沙棘黄酮可抑制三种肿瘤细胞生长,促进细胞凋亡,降低癌细胞Bcl-2/Bax比值,提高Caspase-3酶活力。其作用机理与通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达和激活Caspase-3酶诱导肿瘤细胞凋亡有关。