拟南芥胱硫醚-γ-合成酶(D-AtCGS)基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

摘要

蛋氨酸作为含硫必需氨基酸,具有重要的生理功能。它不仅是蛋白质的构成成分,而且是mRNA翻译的起始氨基酸。其下游产物硫腺苷甲硫氨酸是生物体内最重要的甲基供体,同时还具有转硫、转氨丙基的作用；其衍生物硫甲基甲硫氨酸是重要的硫转运分子,与生物硫代谢密切相关。蛋氨酸能促进动物身体及毛发生长,对肝脏有保护作用,并参与血球素的形成。缺乏时会引起食欲减退,体重迅速下降,还可引发脂肪肝、卵磷脂缺乏、毛发变质、肌肉萎缩和贫血等现象。人和非类反刍动物不能自身合成蛋氨酸,只能依靠日常膳食摄取,但目前主要作物的蛋氨酸含量普遍较低,大豆作为优质蛋白来源,蛋氨酸含量仅占种子总蛋白的1.1％-1.6％。现有大豆品种资源蛋氨酸含量遗传变异相当有限,给通过常规育种方法培育高蛋氨酸品种带来了很大限制,转基因技术的出现,为该问题的解决提供了新的途径。
　　 胱硫醚-γ-合成酶(Cystathionine-γ-synthase,CGS)是蛋氨酸合成的关键酶,它催化O-酸高丝氨酸(O-phospho-L-homoserine,OPH)形成胱硫醚,胱硫醚在胱硫醚-β-裂合酶、甲硫氨酸合成酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶的作用下,最终生成蛋氨酸。CGS与TS的Km值相近,对OPH的利用效率取决于这两种酶的含量。大量的研究表明CGS的表达受到底物的反馈抑制。因此,在利用基因工程手段进行调控时,需对CGS基因的分子结构进行改造,减少底物反馈抑制作用。对拟南芥CGS的研究表明,其N端99-128位的30个氨基酸与催化作用无关,将其删除后反馈抑制作用明显减弱,过量表达这种N端删除的CGS基因更利于培育蛋氨酸含量提高的转基因植物。本实验室用N端删除的AtCGS基因(D-AtCGS)转化大豆及豆科模式植物百脉根,进行蛋氨酸合成调控研究及高蛋氨酸大豆的分子育种,目前已成功获得了多个转基因株系。
　　 本实验以N端删除的AtCGS基因D-AtCGS为目的基因,构建原核表达载体,对D-AtCGS进行了原核表达,制备了抗血清,并利用制备的抗血清对本实验获得的多种转D-AtCGS基因大豆材料和都可模式植物百脉根进行了Western blot及ELISA检测,结果表明转基因植株的检测信号明显高于野生型对照,最终成功的建立了D-AtCGS转基因植物的免疫学检测方法,本研究可为植物CGS表达调控研究及大豆和其他作物的CGS转基因植株检测提供理想的技术支持。