摘要
1 绪论
1.1 重金属污染来源、现状及危害
1.1.1 重金属污染来源
1.1.2 重金属污染的现状
1.1.3 重金属污染的危害
1.2 重金属污染的治理方法及初理
1.3 重金属污染的生物修复
1.3.1 微生物修复
1.3.2 植物修复
1.3.3 植物-微生物联合修复
1.3.4 基因工程在生物修复中的应用
1.4 重金属逆境胁迫
1.4.1 重金属逆境对微生物的影响及其调控机制
1.4.2 植物对重金属逆境的响应及其调控机制
1.5 谷胱甘肽及其合成酶的研究进展
1.5.1 谷胱甘肽(GSH)的合成及调控
1.5.2 谷胱甘肽介导的植物重金属耐受性机制
1.5.3 通过谷胱甘肽相关基因遗传操作来提高植物重金属耐性
1.5.4 谷胱甘肽合成酶的研究进展
1.6 能源甜菜及其重金属生物修复潜力
1.6.1 能源植物种类
1.6.2 我国能源植物开发利用的现状及所面临的问题
1.6.3 能源甜菜的研究现状
1.7 本研究目的意义
2 StECS-GS和AtGCS、AtGS基因的克隆及重金属逆境胁迫的表达特性分析
2.1 材料和方法
2.1.1 植物材料及逆境处理
2.1.2 实验试剂、载体、菌株及培养基
2.1.3 拟南芥总RNA的提取
2.1.4 拟南芥AtGCS和AtGS基因的克隆
2.1.5 嗜热链球菌StECS-GS基因的克隆
2.1.6 AtGCS、AtGS及StECS-GS基因的生物信息学分析
2.1.7 重金属逆境胁迫下拟南芥AtGCS、AtGS基因的转录表达特性
2.2 结果与分析
2.2.1 拟南芥AtGCS、AtGS及嗜热链球菌StECS-GS基因的克隆
2.2.2 拟南芥AtGCS、AtGS和嗜热链球菌StECS-GS基因序列分析
2.2.3 重金属逆境胁迫下Arabidopsis AtGCS、AtGS基因表达特性的研究
2.3 本章小结
3 过量表达AtGCS、AtGS及StECS-GS大肠杆菌的重金属耐受性分子机制及生物修复功能研究
3.1 材料和方法
3.1.1 菌株、表达载体和培养基
3.1.2 分子生物学常用试剂
3.1.3 蛋白相关缓冲液
3.1.4 pETM-20-StECS-GS、AtGCS及AtGS原核表达载体的构建及转化
3.1.5 pETM-20::rage重组质粒的构建
3.1.6 大肠杆菌BL21感受态的制备与转化
3.1.7 融合蛋白的表达与纯化
3.1.8 SDS-PAGE电泳、染色及脱色
3.1.9 重组大肠杆菌的重金属耐受性分析
3.1.10 重金属富集分析及细胞谷胱甘肽浓度测定
3.1.11 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 大肠杆菌表达载体pETM-20-AtGCS、AtGS、StECS-GS重组质粒的构建及鉴定
3.2.2 TrxA-AtGCS、AtGS、StECS-GS融合蛋白在BL21中的表达与纯化
3.2.3 过量表达TrxA-AtGCS、AtGS、StECS-GS重组大肠杆菌的重金属耐受性
3.2.4 过量表达TrxA-AtGCS、AtGS、StECS-GS的重组大肠杆菌的重金属生物富集能力及细胞GSH水平
3.2.5 其它重金属抗性相关蛋白在重金属生物修复的分子初制中的对比研究
3.3 本章小结
4 转StECS-GS和AtGCS、AtGS基因拟南芥在重金属逆境生物修复分子机制中的比较研究
4.1 材料和方法
4.1.1 植物材料及逆境处理
4.1.2 实验试剂及培养基
4.1.3 pENTR/SD/D-TOPO-AtGCS、AtGS、StECS-GS入门载体构建
4.1.4 pGWB2-AtGCS、AtGS、StECS-GS植物表达载体构建
4.1.5 拟南芥的遗传转化Agrobacterium-mediated dip flora transfomation
4.1.6 转基因拟南芥植株的分子鉴定
4.1.7 转基因拟南芥植株的重金属耐受性分析
4.1.8 重金属含量测定
4.1.9 谷胱甘肽及植物螯合素含量测定
4.1.10 数据分析
4.2 结果与分析
4.2.1 入门载体pENTR/SD/D-TOPO-AtGCS、AtGS、StECS-GS的构建
4.2.2 植物表达载体pGWB2-AtGCS、AtGS、StECS-GS的构建及鉴定
4.2.3 拟南芥的遗传转化及转基因植株的分子鉴定
4.2.4 转基因拟南芥植株的重金属耐受性分析及比较研究
4.2.5 AtGCS、AtGS、StECS-GS转基因拟南芥植株对重金属富集能力的比较研究
4.2.6 AtGCS、AtGS、StECS-GS转基因植株的GSH和PC含量的比较研究
4.3 本章小结
5 利用StECS-GS转基因能源甜菜进行重金属逆境生物修复的初探
5.1 材料和方法
5.1.1 植物材料及逆境处理
5.1.2 实验试剂
5.1.3 甜菜转基因植株的遗传转化
5.1.4 转基因甜菜植株的分子鉴定
5.1.5 转基因甜菜植株的重金属胁迫下的表型分析
5.1.6 转基因植株叶绿素总含量测定
5.1.7 甜菜植株体内重金属、GSH和PC含量测定
5.1.8 数据分析
5.2 结果与分析
5.2.1 StECS-GS基因对甜菜的遗传转化
5.2.2 转基因StECS-GS甜菜植株的分子鉴定
5.2.3 转基因StECS-GS甜菜植株的重金属耐受性分析
5.2.4 转基因StECS-GS甜菜植株在重金属逆境下的根长和鲜重分析
5.2.5 转基因StECS-GS甜菜植株的叶绿素含量分析
5.2.6 转基因StECS-GS甜菜植株重金属生物富集量分析
5.2.7 转基因StECS-GS甜菜植株体内GSH和PC含量分析
5.2.8 复合重金属污染条件下,转基因StECS-GS甜菜的重金属耐受性分析及重金属富集量测定
5.3 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
声明
东北林业大学;