藏羚羊传染性胸膜肺炎和华南虎鼻气管炎的首次确诊与流行病学研究

摘要

山羊传染性胸膜肺炎是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)感染山羊引起的一种高度接触性呼吸道传染病，以高热、高发病率、高死亡率及胸膜炎、纤维素性肺炎为特征，对非洲、亚洲等国家的羊养殖业造成严重危害，被世界动物卫生组织列为法定报告传染病。野生羊类的病死和流行报道十分罕见。
　　猫鼻气管炎又称猫传染性鼻气管炎，是由猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)引起的一种传染性较强的猫科动物上呼吸道疾病，在我国等多个国家广泛流行，死亡病例多见于幼龄个体。华南虎的致死性感染和虎源FHV-1的分离鉴定未见有相关报道。
　　2012-2013年，西藏那曲地区藏羚羊发生大批量死亡事件，我们通过电镜观察、组织病理学检查、特异性PCR/RT-PCR、基因序列进化分析、病原分离鉴定等方法，首次确认了藏羚羊传染性胸膜肺炎疫情;继而通过流行病学调查发现本病最早可能发生于2006年，风险分析与评估表明该病呈现地方性流行且在家羊和野生小反刍兽间互相传播的风险很高。此外，我们还确认了深圳野生动物园的华南虎死亡病例系由猫病毒性鼻气管炎感染所致。主要研究内容和结果如下:
　　一、藏羚羊疑似疫情的现场调查与初步诊断
　　1.流行病学调查发现，西藏境内曾发生过与山羊传染性胸膜肺炎症状十分相似的家羊“疑难病”和藏羚羊“肺热病”;明确了西藏那曲地区申扎、双湖、尼玛和班戈4县内藏羚羊种群数量的统计值和估计值。
　　2.疑似疫情发生地死亡藏羚羊的临床症状和剖检，可见鼻腔和口腔流出白色泡沫状液体，明显局限于胸腔内的肺脏“肝样变”及肺表面、胸膜上有白色附着物和灰绿色纤维素膜;在申扎、双湖、尼玛3县采集到13只死亡藏羚羊的肺组织等样品。
　　3.5只藏羚羊肺脏的组织病理学检查，呈现单核细胞和嗜中性白细胞大量渗出、肺泡内大量浆液和纤维素渗出等不同病程的纤维素性肺炎病变，及以肺间质增宽明显、组织坏死、浆液和炎性细胞浸润为主的间质性肺炎病变。处理后的SH3肺脏样品用透射电子显微镜观察，可见到大量直径介于100nm～300nm，呈螺旋状等多形性的支原体样颗粒。
　　4.以丝状支原体簇16S rRNA基因引物对13份藏羚羊肺脏样品进行特异性PCR检测，结果有11份样品扩增获得了785bp目的片段。11份阳性克隆质粒的测序和序列比对结果显示，11条寡核苷酸片段间的序列同源性约为99.8％，其与牛群7支原体等丝状支原体簇成员的同源性在99.2％以上，与Mccp的同源性最高。Mccp arcD基因的特异性PCR结果，11份样品均扩增获得了316bp目的片段。
　　根据上述调查和检测结果，将西藏那曲地区藏羚羊群发性死亡事件，初步诊断为Mccp引起的山羊传染性胸膜肺炎疫情。
　　二、Mccp分离鉴定及对藏羚羊致病性确立
　　1.将13只藏羚羊的肺组织样品处理后接种改良的Hayflick's肉汤，经过2-3次连续传代培养，11份样品的培养物均能够观察到支原体生长。
　　2.11份样品的阳性培养物在电子显微镜观察下，均可见短杆状支原体样颗粒;特异性PCR结果显示，11份培养物中丝状支原体簇5个成员(MmmSC、MmmLC/Mmc、Mcc和M1)的PCR均为阴性，Mccp arcD基因和H2基因PCR为阳性，扩增分别得到316bp、562bp目的片段;将其中SH3样品对应的H2基因PCR产物进行回收、克隆、测序、比对和进化分析，显示所获寡核苷酸序列与其它Mccp分离株间的序列同源性较高(99.3％～99.7％)，与非洲和亚洲的Mccp分离株属于同一进化分支。
　　3.对可能感染藏羚羊的16种病原体进行特异性PCR/RT-PCR检测，13份藏羚羊肺样品中BTV、MVV、CAEV、FMDV、RPV、BPIV、Cb、Cw、Ps、Mb、Ml、MmmLC/Mmc、Mcc、MmmSC、Movi的扩增结果全部为阴性。
　　上述方法和结果表明，成功从藏羚羊样品中分离鉴定了Mccp，排除了16种病原体感染藏羚羊的可能，进而确认了Mccp对藏羚羊的感染、高度致死性和那曲地区藏羚羊CCPP疫情。
　　三、藏羚羊CCPP流行特点和风险分析及防控探讨
　　1.利用特异性PCR方法，分别对2013年3月西藏阿里地区送检的8份死亡家山羊肺组织样品和2013年9月西藏那曲地区申扎县、尼玛县送检的5份死亡藏羚羊肺组织样品进行检测，均扩增得到Mccp arcD基因的316bp目的片段;各取其中1份阳性克隆质粒进行测序和分析，结果显示家山羊和藏羚羊Mccp arcD基因序列间及与其它Mccp分离株间具有有较高的序列同源性(99.4％～99.8％)。
　　2.疫情统计发现，自2012年9月9日起，西藏那曲地区CCPP疫情已间断性发生约505天，共监测到藏羚羊等2亚科、4属（种）、2869只野生小反刍兽死亡，涉及4个县、10个乡（镇）的26处疫点。
　　3.流行特点分析表明，藏羚羊的种群死亡率最高达18.92％，其死亡数（2648只）占比为91.54％;疫点相对集中在色林错湖周边并呈环状分布，该区域内易感物种死亡数量占总数的84.04％; CCPP疫情可划分为2个差异明显的流行周期，流行动力逐渐衰减;死亡动物的雌雄比平均为68∶32，CCPP在4物种的可能潜伏期为7天～16天。
　　4.流行风险分析表明，CCPP可能在2006年前即已流行于西藏阿里地区的家山羊和那曲地区的藏羚羊中;盘羊作为Mccp储存宿主的可能性最高;家羊引种调运、过载放牧、散放游牧以及藏羚羊迁徙是CCPP流行的主要风险因素;这些因素与天气剧烈变化的叠加可能导致了本次藏羚羊CCPP疫情的暴发和区域性流行;CCPP呈现地方性流行并在家羊和野生小反刍兽间互相传播的风险很高，向那曲周边地区、省份扩散的风险较高。
　　5.防控措施方面，建议开展家羊用CCPP火活疫苗及野生动物CCPP流行病学调查、风险评估、经水口服疫苗等科研攻关，并将山羊传染性胸膜肺炎纳为农业、林业部门的法定报告传染病管理，加大家羊的产地检疫、野生小反刍兽的种群监测等。
　　四、华南虎中FHV-1的分离鉴定及流行风险的调查评估
　　1.采用特异性PCR/RT-PCR方法，对深圳野生动物园的死亡华南虎样品进行FHV-
　　1、CDV/FeDV和FCV检测，结果显示仅FHV-1的292bp目的片段得到特异性扩增;基于FHV-1 TK基因(253bp)和gB基因(566bp)寡核苷酸片段的序列比对和系统进化分析表明，其与FHV-1参考毒株高度同源，亲缘关系密切。
　　2.接种样品后的F81单层细胞出现明显的CPE;培养物透射电子显微镜下可观察到典型疱疹病毒特征的颗粒;培养物PCR/RT-PCR核酸检测结果仅FHV-1呈阳性。
　　3.细胞培养物接种实验猫后，发病猫表现为鼻、眼睑等部位的分泌物增多，上呼吸道症状和持续性体温升高;鼻洗液和咽拭子等样品的PCR检测结果呈阳性，显示攻毒猫从第6天开始排毒并持续至第20天。
　　4.通过特异性PCR方法，对深圳野生动物园开展FVR流行调查和风险评估，结果显示所采集的流浪猫等动物的鼻喉拭子样品PCR结果全部为阴性，表明华南虎的死亡情况属于“个案”;风险分析认为，猫病毒性鼻气管炎(FVR)形成区域性流行的风险较低，但散发病例出现的风险较高。
　　5.在华南虎FVR的防控中，应采取加强饲养管理、常态化防疫、疫病调查和风险管理、药物储备等综合措施，不建议进行疫苗接种免疫。
　　通过上述检测、分离鉴定和调查，成功分离到1株华南虎源FHV-1，初步明确了FVR对华南虎的致病性、散发风险和防控措施。
　　本研究分别对野外种群藏羚羊和圈养华南虎的两次疫情、死亡事件进行了实验室诊断、流行病学调查与风险分析，研究结果为上述两种传染病的防控措施制定和濒危野生动物保护提供了重要依据和有力支撑。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 CCPP研究进展

1．2．1 CCPP病原学

1．2．2 CCPP诊断

1．2．3 CCPP流行病学

1．2．4 CCPP防控

1．3 藏羚的分类进化与分布

1．3．1 藏羚的分类与进化

1．3．2 藏羚的分布与数量

1．3．3 藏羚的迁徙规律

1．4 FVR研究进展

1．4．1 FVR与FHV-1

1．4．2 FHV-1致病机理

1．4．3 FVR临床症状

1．4．4 FVR诊断

1．4．5 FVR流行病学

1．4．6 FVR防治

1．5 华南虎保护与常见传染病

1．5．1 华南虎的分类

1．5．2 华南虎的分布与数量

1．5．3 猫科动物常见传染病

1．6 本研究目的意义

2 实验1 藏羚羊疑似疫情的现场调查与初步诊断

2．1 材料和仪器

2．1．1 调查问卷

2．1．2 组织样品

2．1．3 实验器材

2．1．4 实验试剂

2．1．5 PCR引物

2．2 实验方法

2．2．1 信息调查

2．2．2 样品采集

2．2．3 病理学和电镜检查

2．2．4 分子生物学检测与分析

2．3 实验结果

2．3．1 信息调查

2．3．2 临床症状与剖检病变

2．3．3 组织病理学观察

2．3．4 电镜观察

2．3．5 分子生物学检测

2．4 讨论与结论

2．4．1 关于信息调查

2．4．2 关于藏羚羊疑似疫情的初步诊断

3 实验2 Mccp分离鉴定及对藏羚羊致病性确立

3．1 材料和仪器

3．1．1 实验样品

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．1．4 PCR引物

3．2 实验方法

3．2．1 支原体分离培养

3．2．2 TEM检查

3．2．3 分子生物学检测与鉴定

3．3 实验结果

3．3．1 支原体分离培养结果

3．3．2 TEM镜检结果

3．3．3 分子生物学检测与鉴定结果

3．4 讨论与小结

3．4．1 关于Mccp的分离与鉴定

3．4．2 关于Mccp对藏羚羊的致病性

3．4．3 关于Mccp藏羚羊分离株的遗传进化地位

4 实验3 藏羚羊CCPP流行特点和风险分析及防控探讨

4．1 材料和仪器

4．1．1 实验样品

4．1．2 实验仪器

4．1．3 实验试剂

4．1．4 PCR引物

4．1．5 藏羚羊本底数据

4．2 实验方法

4．2．1 样品处理

4．2．2 分子生物学检测与分析

4．2．3 CCPP流行病学特点分析

4．2．4 CCPP流行风险分析

4．3 实验结果与分析

4．3．1 分子生物检测与分析

4．3．2 CCPP疫情统计

4．3．3 CCPP流行病学特点分析

4．3．4 CCPP传播风险分析

4．3．5 CCPP的防控探讨

4．4 讨论与小结

5 实验4 华南虎中FHV-1的分离鉴定及流行风险评估

5．1 材料和仪器

5．1．1 实验样品

5．1．2 实验仪器

5．1．3 实验试剂

5．1．4 PCR／RT-PCR引物

5．1．5 分离用细胞

5．1．6 实验动物

5．2 实验方法

5．2．1 病料处理

5．2．2 分子生物学鉴定

5．2．3 病毒分离

5．2．4 电子显微镜观察

5．2．5 动物回归实验

5．3 实验结果

5．3．1 FHV-1的分子生物学检测与鉴定

5．3．2 病毒分离

5．3．3 TEM观察

5．3．4 动物回归实验

5．4 讨论与小结

5．4．1 关于FHV-1对华南虎的致病性

5．4．2 关于华南虎FHV-1感染的可能来源

5．4．3 关于华南虎FVR的流行风险

5．4．4 关于FVR的防治措施

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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