牛传染性鼻气管炎病毒抗体间接ELISA的建立及其在流行病学研究中的应用

摘要

牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由Ⅰ型牛疱疹病毒引起的、牛的一种以上呼吸道炎症为主的急性、热性、接触性传染病。主要引起呼吸道和生殖道疾病，如传染性鼻气管炎、流产、传染性脓疱性外阴道炎、新生儿的全身性感染。自从1928年被首次证实以来，IBRV就在世界各地广泛存在，尽管其流行情况不尽相同，但给养牛业造成了巨大的经济损失。随之而来的控制措施在北美和欧洲迅速展开，但只有奥地利、丹麦、芬兰、挪威、瑞典和瑞士彻底根除了此病。IBR被国际兽疫局(OIE)列为B类疾病，属我国进境动物和国际动物贸易重点检疫的对象之一。目前防制该病的主要措施是接种疫苗，根治方法是阳性牛检出与捕杀。因此，建立灵敏、快速的诊断方法十分必要。 IBRV基因组为线性双股DNA，G+C含量为71-72％，大小约为138Kb，被两个重复序列单位(RS：一个在内部，一个在末端，每一个11Kb)分割成一长的单一序列(UL：106Kb)和一短的单一序列(US：10Kb)，约含54～59个基因，编码11种糖蛋白。糖蛋白G(gG)是病毒复制非必需的分泌性蛋白，可影响病毒在宿主细胞内有效增殖与细胞间扩散，与病毒毒力相关。gG具有很强的抗原性，是许多疱疹病毒的诊断抗原，被广泛用于其它疱疹病毒感染性疾病的血清学诊断。因此，本研究克隆表达了牛传染性鼻气管炎病毒gG，建立了gG-ELISA诊断方法，并运用该方法对中国IBRV的血清流行病学作了初步调查。主要工作包括： 1.IBRV gG基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 以牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因组DNA为模板，PCR扩增gG基因，克隆到T载体pMD18-T，经限制性酶切分析及序列测定鉴定正确后，进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG。SDS-PAGE和Western blot分析表明，该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中呈可溶性及包涵体两种形式表达，重组蛋白质具有免疫学活性。 2.gG-ELISA的建立 包涵体蛋白经提纯、变性、复性后，作为包被抗原建立了gG-ELISA诊断方法。方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为1：640，即0.585 μg/孔，最佳血清稀释浓度为1：50。选取60份经进口试剂盒检测为阴性的奶牛血清，进行gG-ELISA检测。 牛传染性鼻气管炎抗体间接ELISA检测方法的建立及其在流行病学研究中的应用计算该60份血清的平均值X与标准差SD，60份阴性血清OD630值为X±0.025，求得阴阳界限为0.299。应用该方法与进口试剂盒(IDEXX)平行检测380份血清样品，两种方法的符合率为92％(351/380)。同时，还用该方法与中和试验平行检测了38份实验室保存的血清样品，两者的总符合率为74％(28/38)。取6份抗体水平不同的血清样品在同一批试验中每份样品平行作6次(批内)，又在6个不同试验日重复测定6份样品(批间)，结果批内、批间重复的吸收变异系数均小于10％，说明此方法重复性好。对6份病毒分离阳性血清的检测均为阳性，对非相关病原的阳性血清及中监所的阴性血清检测均为阴性，表明所建立的IBRV gG抗体的ELISA检测具有良好的灵敏度与特异性。 3.gG-ELISA对中国奶牛群牛传染性鼻气管炎的血清流行病学调查 为了解牛传染性鼻气管炎在中国的流行情况及地区分布特点，采用分层整群随机抽样方法，抽取中国29个省市的1344份奶牛血清进行了血清流行病学调查。对湖北地区的黑白花奶牛进行了重点抽样。同时，还检测了483份进口奶牛血清。结果显示：牛传染性鼻气管炎在中国各省市几乎都有流行，平均阳性率为35.8％(481/1344)，且不同省市之间变化很大，从12.1％到77.8％不等。湖北省的平均阳性率为22.2％(170/765)，这与全国抽样调查的结果一致。但不同牧场之间的变化范围也很大，从0.0％到41.5％不等。进口奶牛的阳性率为21.7％(105/483)。

目录

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论文说明：缩略语表

声明

1文献综述

1.1 IBR的发展史

1.2 IBR的流行病学

1.3 IBRV的特性

1.4 IBR的分子生物学特征

1.5 IBR的临床症状

1.5.1呼吸道型

1.5.2生殖器型

1.5.3脑膜炎型

1.5.4结膜炎型

1.5.5流产型

1.5.6肠炎型

1.6诊断

1.6.1病毒中和实验

1.6.2 ELISA

1.6.3琼脂扩散试验

1.6.4间接血凝试验

1.6.5病毒分离

1.6.6 PCR法

1.6.7核酸探针检测

1.6.8免疫荧光试验

1.6.9变态反应

1.6.10鉴别诊断

1.7预防和控制

1.7.1常规疫苗

1.7.2 DNA疫苗

1.7.3 亚单位疫苗

1.7.4基因工程缺失苗

1.7.5病毒活载体重组疫苗

2研究目的与意义

3材料与方法

3.1试验材料

3.1.1病毒与菌种

3.1.2质粒及相关试剂

3.1.3参考血清和酶标抗体

3.1.4 血清样本

3.1.5主要试剂及溶液的配制

3.2试验方法

3.2.1病毒增殖与纯化

3.2.2模板制备

3.2.3引物设计与合成

3.2.4 gG基因的PCR扩增

3.2.5 PCR产物的回收与纯化

3.2.6 PCR产物的克隆

3.2.7表达载体的构建

3.2.8大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3.2.9细菌的转化

3.2.10重组质粒小量制备(碱裂解法)

3.2.11重组质粒大量制备(碱裂解法)

3.2.12原核表达

3.2.13表达蛋白的鉴定

3.2.14 ELISA诊断方法的建立

4结果与分析

4.1病毒纯化结果

4.2 PCR扩增和克隆结果

4.3 gG在大肠杆菌中的表达与检测

4.4 gG-ELISA诊断方法的建立

4.4.1 ELISA最适条件及阴阳界限的确定

4.4.2 pGEX-KG空载体表达蛋白工作浓度的确定

4.4.3重复性试验

4.4.4特异性试验

4.4.5符合率试验

4.5血清流行病学调查结果

4.5.1 IBR在全国的流行情况

4.5.2 IBR在湖北省的流行情况

5讨论

6结论

参考文献

附录

致谢