农杆菌介导ClCBF1基因转化地被菊‘雪公主’的研究

摘要

地被菊(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)是菊花中具有植株低矮、抗逆性强、管理粗放和花紧密等特点的一个品种群。由于其盛花期在“十一”前后，这一新型菊花已在很多地区得到推广和应用。但是，这种新型菊花在我国北方应用受到的一个限制性因素就是在秋冬季露地生长情况下绿期较短。因此，开展培育耐寒性较强的品种并加以应用显得尤为重要。大量的研究已表明CBF1转录因子能够通过引起一些冷诱导基因的表达，从而达到提高植物总体的抗寒能力。本试验旨在通过对地被菊‘雪公主’高效再生体系及根癌农杆菌介导的转化体系的研究，将CICBF1转录因子导入到其中，以期望获得抗性较强的新品种，并为广泛运用转基因技术改良菊花品种打下基础。主要研究结果如下:
　　本研究以地被菊‘雪公主’为试验材料，研究了不同激素浓度配比和叶片发育程度对叶片再生能力的影响，以及对茎段分化和生根诱导的影响。由此对‘雪公主’的再生条件进行了优化，从而获得了高效的再生体系。试验结果表明，地被菊‘雪公主’着生在植株顶端的幼嫩叶片比着生在植株基部的叶片分化率高;同一叶片基部的分化率高于中部;其最佳诱导分化培养基为MS+1.0mg·L-16-BA+0.6mg·L-1NAA;茎段增殖的最适培养基为MS+0.3mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA;继代培养为MS培养基;生根培养基为1/2MS+0.5mg·L-1NAA培养基;再生苗移栽后生长良好。
　　在高效再生体系建立的基础上，利用根癌农杆菌介导的遗传转化法对其遗传转化进行了研究。试验结果表明，最优的转化体系为:在最佳诱导分化培养基上经过预培养1d的叶盘置于OD600为0.5～0.6的菌液中侵染10min，共培养2d后将叶盘接到MS+0.6mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA+5mg·L-1Km+350mg·L-1Carb培养基上进行延迟筛选，3d后接种到MS+0.6mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA+5mg·L-1Km+200mg·L-1Carb分化筛选培养基中，待分化出不定芽后，将1.5cm左右的不定芽接到1/2MS+0.5mg·L-1NAA+4mg·L-1Km的培养基中进行生根筛选。利用此体系进行了稳定的遗传转化，有效地提高了转化效率。
　　本研究在经过长期的卡那霉素生根筛选得到12株抗性植株的基础上，分别提取获得的抗性地被菊单株的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果共获得阳性植株2株，转化率为0.67％。之后提取阳性植株的RNA进行RT-PCR检测，得到了与阳性对照CICBF1(633bp)目的基因相同的特异性片段，从分子水平上证明目的基因CICBF1已整合到地被菊‘雪公主’的基因组中。转基因试管苗经过炼苗和移栽，1个月后全部成活。

目录

摘要

1 绪论

引言

1．1 菊花转基因的研究进展

1．2 CBF转录因子的研究进展

1．3 本研究的目的意义

2 地被菊‘雪公主’高效再生体系的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 数据分析方法

2．3 结果与分析

2．3．1 消毒时间对污染率的影响

2．3．2 不同激素浓度对叶片分化率的影响

2．3．3 不同发育程度的叶片之间分化率的差异

2．3．4 同一叶片的不同部位之间分化率的差异

2．3．5 茎段的增殖

2．3．6 继代生根

2．3．7 炼苗移栽

2．4 本章小结

3 ClCBF1基因转化地被菊‘雪公主’的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 研究方法

3．2 结果与分析

3．2．1 卡那霉素对叶片分化率的影响

3．2．2 卡那霉素对植株生根的影响

3．2．3 羧苄霉素对叶片脱菌浓度的确定

3．2．4 预培养时间的确定

3．2．5 农杆菌侵染时间的确定

3．2．6 共培养时间的确定

3．2．7 延迟培养时间的确定

3．3 本章小结

4 转基因植株的筛选及鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 抗性芽的生根筛选

4．2．2 抗性株PCR检测

4．2．3 RT-PCR检测

4．3 本章小结

5 讨论

6 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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