长春花活性成分时空动态及其抗氧化抗炎活性研究

摘要

长春花是最重要的药用植物之一，主要是由于其含有抗癌生物碱。本文确定了一种新型环保，同时从长春花叶片中提取五种吲哚生物碱文多灵，长春质碱，长春新碱，长春碱和脱水长春碱的酶辅助负压空化提取方法。通过检测温室栽培长春花不同生长月份各器官的生物量动态和五种吲哚生物碱的含量动态，确定了其最佳采收期。同时研究了长春花叶片提取物的抗氧化潜力及其对脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分泌炎症因子的调节作用。主要结论如下:
　　1.长春花生物碱酶辅助提取工艺
　　以五种主要的吲哚生物碱为检测指标，利用响应面优化方法，选择四个因素的最佳水平（浓度、pH值、温度、时间）进行优化实验。
　　最佳条件是:0.61％(w/w干物质)的果胶酶和0.61％β-葡萄糖苷酶的组合，酶溶液pH值为4.73，提取温度为35.87℃，提取时间8.62小时。在酶辅助负压空化提取方法的最佳条件下，五种吲哚生物碱文多灵、长春质碱、长春碱、长春新碱和脱水长春碱提取率达到4.940±0.215，6.283±0.307，0.049±0.002，0.066±0.003和0.038±0.001mg·g-1，与正常负压空化提取方法相比分别增加了28％，34％，33％，27％和37％。
　　2.长春花活性成分时空动态变化
　　以温室栽培长春花为实验材料，采用高效液相色谱法研究长春花不同生长月份（当年4月到次年1月）、各器官（根、茎和叶）的五种生物碱含量动态，结果如下:
　　所检测的五种生物碱含量受季节和组织部位的影响，叶片中文多灵和长春质碱含量最高，茎中所有生物碱含量均较低，根中长春碱含量较高，仅次于叶;8月文多灵和长春质碱含量最高，9月长春新碱含量最高;生物碱总量8月最高，根、茎和叶分别为5.61mg·g-1、1.90mg·g-1和8.63mg·g-1。结论是8月为长春花的最佳采收期。
　　3.长春花中活性生物碱抗氧化活性
　　研究了了长春花提取物体外抗氧化活性。采用分光光度法，测定长春花提取物的总抗氧化能力和1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)的清除能力，通过多元线性回归分析，考察长春花提取物含量及其体外抗氧化活性的相关性。
　　结果表明长春花提取物总抗氧化能力和DPPH自由基清除作用均较好，根的IC50值为153μg·mL-1，茎的IC50值为476μg·mL-1，叶片的IC50值为447μg·mL-1，长春花不同组织部位提取物对DPPH自由基清除能力:根的提取物＞叶片的提取物＞茎的提取物。在供试质量浓度范围内对自由基的清除效率与长春花提取物浓度有一定量效关系。3种提取物对ABTS自由基清除率均超过了80％，根的清除率最高可达96.11％。说明长春花提取物具有显著的体外抗氧化作用。
　　4.长春花初步抗炎活性与机理
　　初步研究了长春花提取物对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导RAW264.7细胞产生IL-6和TNF-α的作用，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测0.012，0.06和0.3 mg·mL-1低、中、高3个浓度长春花提取物对终浓度为10μg·mL-1 LPS诱导RAW264.7细胞产生白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。
　　结果表明LPS能够明显诱导小鼠RAW264.7细胞产生IL-6、TNF-α，长春花提取物低、中、高3个浓度均能抑制LPS诱导产生IL-6和TNF-α，呈现剂量依赖性。长春花提取物可以抑制LPS所致的RAW264.7细胞炎症反应，其抗炎作用可以减少炎症细胞因子IL-6、TNF-α的生成。

目录

摘要

1 绪论

1．1 概述

1．2 长春花的基本特征和药性

1．2．1 长春花的基本特征

1．2．2 长春花药性

1．3 长春花中吲哚生物碱的分类

1．4 长春花中生物碱的活性

1．4．1 抗氧化活性

1．4．2 抗炎活性

1．5 本研究目的和主要内容

2 长春花生物碱酶辅助提取工艺

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料和方法

2．2．2 样品的测定方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 酶辅助提取工艺优化

2．3．2 酶辅助机制

2．3．3 BBD试验

2．3．4 不同提取方法的比较

2．3．5 电子显微镜扫描

2．4 本章小结

3 长春花活性成分时空动态变化

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 方法

3．2．2 结果与分析

3．2．3 小结

4 长春花提取物抗氧化活性研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 标准品和试剂

4．2．2 试剂配制

4．2．3 样品制备

4．2．4 高效液相色谱分析

4．2．5 抗氧化活性

4．3 结果与讨论

4．3．1 DPPH自由基清除能力

4．3．2 总黄酮含量

4．3．3 总酚含量

4．3．4 ABTS法检测长春花总抗氧化能力

4．4 本章小节

5 长春花初步抗炎活性

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 标准品、试剂和仪器

5．2．2 样品和细胞培养

5．2．3 Griess实验细胞处理

5．2．4 长春花提取物对LPS诱导小鼠RAW264．7细胞株的IL-6和TNF-α产物的作用

5．2．5 长春花提取物对LPS刺激RAW246．7细胞释放细胞因子的影响

5．2．6 长春花提取物对细胞活力影响的测定(MTT法)

5．2．7 统计分析

5．1 结果与讨论

5．3．1 长春花提取物对LPS诱导细胞产生NO的抑制作用

5．3．2 长春花提取物对LPS诱导小鼠RAW264．7细胞株的IL-6和TNF-α的作用

5．2 本章小节

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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