犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病(Ⅰ型)三联活疫苗的研制

摘要

犬瘟热(Canine distemper，CD)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)病及犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)病是当前对我国养犬业危害严重的3种病毒性传染病。常引起大批犬、貂和狐等动物发病，经济损失惨重。犬瘟热病毒(Caninedistemper virus，CDV)可以感染包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、灵长目的猕猴属、偶蹄目猪科和鳍足目海豹科等多种动物。CPV可引起犬出血性肠炎与心肌炎，此外，CPV还可引起虎、狮、果子狸和猴等野生动物的感染。CAV不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。
　　疫苗免疫被认为是犬病防控的最直接有效措施。当前，广泛应用的主要有单价或多价弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用，但是还时有疫情发生的报道。同时，目前使用的这些的疫苗大部分为国外疫苗的复制品，其使用的疫苗株与我国优势流行株之间抗原差异显著。因此，研制适合国内流行毒株的疫苗已迫在眉睫。鉴于此，开展以下研究:
　　CDV、CPV及CAV的分离鉴定:将发病犬的病料组织等经过处理后，分别接种鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）、CRFK及MDCK细胞进行传代培养，并进行病毒形态学、PCR及动物回归试验鉴定等一系列鉴定。CDV、CPV及CAV的细胞培养物上清电镜观察分别可见典型的副黏病毒粒子、细小病毒粒子和腺病毒粒子。动物回归试验显示，三种分离株分别可导致犬出现明显的相应的临床症状。PCR和序列分析进一步确定分离株分别为CDV、CPV和CAV的野毒株，并分别命名为CDV-YB、CPV-YN和CAV-H。
　　CDV、CPV及CAV的致弱研究:CDV-YB株分别经CEF、Vero和CEF细胞连续传70、20和15代，CPV-YN和CAV-H分别经CRFK和MDCK细胞连续传至110代，病毒滴度逐渐提高并分别稳定在106.5 TCID50/mL、106 TCID50/mL和107.5 TCID50/mL左右。并且三种病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐降低。动物回归试验结果进一步表明成功获得致弱毒株，分别命名为CDV-YBR、CPV-YNR和CAV-HR。
　　CDV、CPV及CAV致弱毒株的免疫原效力评价:分别将三种致弱毒株免疫犬，并用亲本强毒株进行攻毒保护试验，结果表明三种致弱毒株均可诱导犬产生理想的中和抗体，并对同源强毒株的攻击提供完全保护。
　　CD、CPV病及CAV病（Ⅰ型）三联活疫苗研制:将致弱毒株CDV-YBR、CPV-YNR和CAV-HR按照比例混匀，加入稳定剂制备三联弱毒疫苗，并对其开展免疫学评价。结果表明:三联活疫苗具有良好的安全性和免疫性原性。与相应单苗相比，二者在免疫效力方面无明显差异。与同类商品化五联活疫苗相比，两者在安全性基本一致;本研究中三联苗在免疫效力方面略胜一筹;在病毒含量和免疫持续期方面均优于商品化疫苗;此外对怀孕母犬进行免疫具有绝对的安全优势。
　　目前，国内应用的弱毒联苗一部分是国外疫苗的复制品，另一部分疫苗种毒直接来自于国外，这与国内目前流行的野毒株在基因水平和抗原性等生物学特性方面存在显著差异，而且，目前商品化疫苗均不适合于怀孕母犬的免疫。而本研究三联弱毒苗的疫苗株均来源于国内优势流行株经致弱而成，有独立知识产权，且制各的疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并对怀孕母犬绝对安全。该三联苗已申报新兽药批号，目前处于复核试验阶段。本研究填补了我国犬类国产疫苗的空白，为我国犬的重要病毒病的防控提供了物质基础和技术储备，并将产生良好的经济效益和社会效益。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 CD概况

1．2．1 CDV的基本结构和特征

1．2．2 cD的防控

1．3 CPV概况

1．3．1 CPV的基本结构和特征

1．3．2 CPV病的防控

1．4 CAV概况

1．4．1 CAV的基本结构和特征

1．4．2 CAV病的防控

1．5 本研究的目的和意义

2 CDV、CPV和CAV-Ⅰ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研究

2．1 实验材料与实验仪器

2．1．1 实验样品

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 病毒分离

2．2．2 病毒鉴定

2．2．3 病毒致弱与免疫效力研究

2．3 实验结果

2．3．1 病毒分离结果

2．3．2 病毒鉴定结果

2．3．3 病毒致弱及免疫效力研究结果

2．4 讨论

3 CD、CPV病和CAV-Ⅰ病三联弱毒疫苗制备

3．1 实验材料与实验仪器

3．1．1 病毒和疫苗

3．1．2 实验动物

3．1．3 实验试剂

3．1．4 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 CDV、CPV和CAV-Ⅰ三种病毒与稳定剂配比的研究

3．2．2 三联活疫苗安全性研究

3．2．3 三联活疫苗对怀孕母犬的安全性研究

3．2．4 三联活疫苗最小免疫剂量研究

3．2．5 三联活疫苗免疫持续期研究

3．2．6 三联活疫苗与各单苗的免疫效力比较

3．2．7 三联活疫苗与同类商品苗的比较研究

3．3 实验结果

3．3．1 CDV、CPV和CAV-Ⅰ三种病毒与稳定剂配比的研究结果

3．3．2 三联活疫苗安全性研究结果

3．3．3 三联活疫苗怀孕母犬的安全性研究结果

3．3．4 三联活疫苗最小免疫剂量研究结果

3．3．5 三联活疫苗免疫持续期研究结果

3．3．6 三联活疫苗与各单苗的免疫效力比较结果

3．3．7 三联活疫苗与市场销售的同类商品苗的比较研究结果

3．4 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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