猪2型圆环病毒病-猪细小病毒病-猪乙型脑炎三联灭活疫苗的研制及对猪的免疫效力试验

摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)主要引起猪多系统功能衰竭性疾病(PMWS)，猪感染该病毒后产生免疫抑制，增加了对多种病原体的易感性。猪细小病毒(PPV)和猪流行性乙型脑炎脑病毒(JEV)均可以引发母猪的繁殖障碍及公猪的种用性能下降等疾病。PCV2与PPV、JEV，给养猪业带来了极大的经济损失，因此种猪均需要免疫接种这三种疫苗。但是目前国内外市场上还没有上述疾病的三联疫苗，给猪病免疫接种带来极大不便。为了有效地防控这三种疾病，简化免疫程序、减少免疫应激、达到一针预防多病的目的，本研究利用实验室自行分离鉴定的XXX株PCV2、XXX株PPV和XXX株JEV，研制出猪2型圆环病毒病-猪细小病毒病-猪乙型脑炎三联灭活疫苗。具体研究内容如下:
　　1、三联灭活疫苗的制备
　　通过在PK-15细胞和BHK-21细胞分别上传代增殖，获得荧光定量拷贝数为XXX的PCV2病毒液，HA毒价为XXX的PPV病毒液和TCID50为XXX的JEV病毒液。对病毒液XXX倍透析浓缩、纯化，等体积混合制备疫苗的水相，加入XXX倍体积油相进行乳化，制备了PCV2-PPV-JEV三联灭活疫苗;对浓缩的上述三种病毒液XXX倍稀释，两两等体积混合，使用同样方法分别制备3种二联灭活疫苗;对浓缩的病毒液XXX倍稀释，制备3种灭活单苗。上述三种病毒在等体积的各种灭活疫苗中同种抗原的含量相同，为单苗、二联和三联灭活疫苗的不同免疫剂量和免疫效果比较奠定基础。
　　2、灭活疫苗的检验
　　按照国家兽药典对灭活疫苗做物理性状及无菌检验结果均符合要求。将灭活疫苗分别对KM小鼠、豚鼠、仔猪、后备母猪和妊娠母猪做了安全性试验。结果表明，受试动物精神、食欲正常，注射部位没有局部不良反应，妊娠母猪分娩率为100％，平均产仔11.4头，新生仔猪中弱仔比例为1.2％，无死胎、木乃伊胎。灭活疫苗对实验动物和本动物安全性良好，对妊娠母猪的繁殖性能和新生仔猪健康状况均无影响，表明本研究灭活疫苗安全可靠。
　　3、灭活疫苗对35日龄仔猪的免疫效力检验
　　本研究中二联、三联灭活疫苗与的相应自制灭活单苗及对照商品单苗的免疫效力比较显示，多联灭活疫苗的不同剂量组免疫效果均高于商品灭活/弱毒疫苗及生理盐水对照组，且在低剂量（1 mL/头）免疫时即可产生较高水平的抗体，同等免疫剂量时，的二联和三联灭活疫苗诱导的抗体水平高于各的灭活疫苗，甚至个别联苗的低剂量免疫组产生的抗体水平也稍高于的灭活疫苗。7种灭活疫苗诱导产生的抗体均能维持10周以上。
　　本研究为猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪乙型脑炎病的联合免疫提供了可能。而且本研究证实了的三联灭活疫苗使用较低剂量（1 mL/头）免疫猪后即可诱导产生相当于或高于商品疫苗的抗体水平。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 猪圆环病毒病及其疫苗研究进展

1．1．1 猪圆环病毒病概述

1．1．2 猪圆环病毒病在我国的流行现状

1．1．3 猪圆环病毒病的防控措施

1．1．4 猪圆环病毒病疫苗研究进展

1．2 猪细小病毒病及其疫苗研究进展

1．2．1 猪细小病毒病概述

1．2．2 猪细小病毒病在我国的流行现状

1．2．3 猪细小病毒病的防控措施

1．2．4 猪细小病毒病疫苗研究进展

1．3 猪乙型脑炎及其疫苗研究进展

1．3．1 猪乙型脑炎概述

1．3．2 猪乙型脑炎在我国的流行现状

1．3．3 猪乙型脑炎的防控措施

1．3．4 猪乙型脑炎疫苗研究进展

1．4 猪圆环病毒2型、猪细小病毒病、猪乙型脑炎多联疫苗的研究进展

1．5 研究目的和意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 细胞系、毒株

3．2 主要试剂及配制

3．3 主要仪器

3．4 试验动物、疫苗

3．5 病毒液的制备

3．5．1 猪圆环病毒2型病毒液的制备

3．5．2 猪细小病毒液的制备

3．5．3 猪乙型脑炎病毒液的制备

3．6 病毒含量测定

3．6．1 猪圆环病毒2型病毒滴度测定

3．6．2 猪细小病毒滴度测定

3．6．3 猪乙型脑炎病毒滴度测定

3．7 疫苗的制备

3．7．1 病毒液的浓缩

3．7．2 病毒液的灭活及灭活效果检验

3．7．3 疫苗水相的制备

3．7．4 疫苗的乳化

3．8 疫苗的检验

3．8．1 物理性状检验

3．8．2 无菌检验

3．8．3 安全性检验

3．9 单苗、二联、三联灭活疫苗对猪的免疫试验分组

3．10 免疫动物血清抗体检测

3．10．1 猪圆环病毒2型ELISA抗体检测

3．10．2 猪细小病毒HI抗体检测

3．10．3 猪乙型脑炎病毒LAT抗体检测

3．11 数据分析

4 结果与分析

4．1 病增值病毒液的病毒含量测定

4．2 病毒液灭活效果检验

4．3 疫苗的检验

4．3．1 疫苗的物理性状检验

4．3．2 疫苗的无菌检验

4．3．3 疫苗的安全性检验

4．4 单苗、二联、三联灭活疫苗对猪的免疫试验

4．4．1 单苗、二联、三联灭活疫苗免疫猪后PCV2 ELISA抗体水平

4．4．2 单苗、二联、三联灭活疫苗对猪免疫后PPV HI抗体水平

4．4．3 单苗、二联、三联灭活疫苗免疫猪后JEV LAT抗体水平

5 结论与讨论

5．1 灭活疫苗病毒液的制备

5．2 灭活疫苗佐剂的选择

5．3 灭活疫苗的安全性

5．4 灭活疫苗的免疫

参考文献

附表 作者读研期间发表文章