东北虎脾cDNA文库构建及EST序列生物信息学分析

摘要

cDNA文库是组织或细胞特定时期全部mRNA信息的集合，利用构建cDNA文库的方式保存东北虎的遗传信息，不仅是科技进步的一种表现，也是东北虎保护中非常重要的环节。
　　本研究分为两个主要部分:
　　1东北虎脾脏cDNA文库的构建
　　首先利用Trizol一步法提取得到东北虎脾脏总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度为0.58μg/μl，OD260/OD280值为1.97，证明所得RNA样品浓度和纯度都符合实验要求;用甲醛变形电泳鉴定RNA样品完整性，所得电泳图显示条带明亮清晰，且28s和18s处条带亮度比例约为2∶1，证明总RNA完整且未降解。然后利用SMARTTM文库构建试剂盒构建东北虎脾脏cDNA文库，总RNA反转录形成双链cDNA，经SfiI酶切和CHROMA SPIN-400分选，收集大于400bp的片段，连接载体λTriplEx2，经噬菌体包装，获得初级文库。测定初级文库的滴度为2.98×106 pfu/mL，重组率为94.6％。扩增初级文库并测定滴度，可得扩增后的文库滴度为9.70×109 pfu/mL。随机挑选23个克隆检测文库插入片段平均长度，统计可得文库插入片段长度集中在500bp～1200bp。以上结果都表明实验中构建的东北虎脾脏cDNA文库符合文库构建质量要求，可以进行后续实验操作。
　　2 EST序列生物信息学分析
　　在扩增文库中随机挑取300个克隆递送测序，共获得273条原始序列。去除小分子片段和测序不准确的片段，共筛选出239条有效EST序列。与GenBank的核酸数据库比对后序列拼接，共获得80条功能注释基因。对这些注释基因进行生物信息学分析。分别进行PANTHER分析、GOrilla分析、PPINet分析和KEGG分析。PANTHER分析中用五种方式对80条注释基因及其蛋白进行分类，并用柱状图和表格的形式显示分类结果;GOrilla分析首先对生物学进程进行串联分析，随后对过程中基因富集程度做出评估。本实验中显示基因富集主要集中在能量保存及新陈代谢过程中，主要富集基因为IQGAP1，CALM1，FASN; PPINet分析蛋白间相互作用，并绘制Cytoscape网络图;本实验从蛋白间相互作用网络图中挑选得到中心基因CALM1和CALR进行KEGG信号通路分析。结果显示CALM1在Ca2+信号通路中表现出关键作用，是细胞钙通道的主要传感器;CALR则作为一种结合蛋白，主要参与多种免疫反应，同时也维持细胞内钙离子稳态。以上这些生物信息学分析结果不仅是对东北虎脾脏遗传信息的初步解读，同时也为东北虎基因组的研究提供了基础数据。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 东北虎相关概述

1．2．1 东北虎简介

1．2．2 东北虎生存保护现状

1．3 cDNA文库相关概述

1．3．1 cDNA文库简介

1．3．2 几种常见的cDNA文库类型

1．3．3 文库质量鉴定

1．3．4 cDNA文库的应用

1．4 表达序列标签相关概述

1．4．1 表达序列标签概念与原理

1．4．2 表达序列标签的应用

1．5 生物信息学相关概述

1．5．1 生物信息学概念

1．5．2 生物信息学的产生

1．5．3 生物信息学的主要步骤

1．5．4 生物信息学的应用

2 东北虎脾脏组织cDNA文库的构建

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 常用试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 Trizol试剂提取东北虎脾组织总RNA

2．2．2 cDNA第一链合成

2．2．3 LD-PCR合成ds cDNA

2．2．4 蛋白酶K消化

2．2．5 Sfil酶切

2．2．6 CHROMA SPIN-400分选不同长度cDNA

2．2．7 cDNA连接载体

2．2．8 噬菌体包装

2．2．9 测定未扩增文库滴度以及重组率鉴定

2．2．10 未扩增文库插入片段平均长度测定

2．2．11 文库扩增

2．2．12 扩增文库滴度测定

2．3 实验结果

2．3．1 东北虎脾脏总RNA提取

2．3．2 双链cDNA合成

2．3．3 cDNA分选

2．3．4 连接反应比例确定

2．3．5 cDNA文库质量鉴定

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 EST序列生物信息学分析

3．1 实验材料

3．1．1 主要分析材料

3．1．2 主要应用软件

3．2 实验方法

3．2．1 挑取克隆并测序

3．2．2 测序结果初步处理

3．2．3 EST序列的聚类拼接

3．2．4 生物信息学分析

3．3 实验结果

3．3．1 EST序列测序结果统计

3．3．2 EST长度分析总结

3．3．3 注释基因总结

3．3．4 PANTHER分类分析

3．3．5 GOrilla分析

3．3．6 PPINet分析

3．3．7 KEGG分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明