产耐高温漆酶疣孢漆斑菌的诱变育种及基因分析

摘要

本文通过化学诱变的方法即用亚硝基胍（NTG）处理疣孢漆斑菌孢子，使其产生随机突变。通过96孔板高通量筛选的方法，筛选出了两株产耐热性能好的漆酶的菌株，命名为MF-01和MF-02，并对其及其产生的漆酶进行了生理指标检测，结果显示，两株突变株与未突变株比较发酵液中的酶活性，pH以及菌体生长量并没有突出变化，发酵液pH均为下降后上升，菌体生长量为线上升后下降。对两个菌株和未突变株的漆酶进行纯化，得到单一纯蛋白。MF-01的反应最适pH值为3.0，pH稳定性最好的时候在pH3.0-3.5。MF-02的反应最适pH值为4.0，pH稳定性最好时候在3.5-4.0，而未突变株的两值分别在pH4.5和pH4-5之间。说明两个突变株更耐酸性，稳定性更好。在热稳定性和最适温度的实验中，突变株MF-01在30-50℃时有相对较高的酶活，但MF-02与未突变株最适温度的差异不是十分明显。当温度上升至70-90℃，酶活均下降至50%以下，但MF-01的酶活性仍然高于MF-02和未突变菌株。同样在50%的相对酶活条件下，突变株漆酶放置的时间更长。经过分析，两株菌株产生的漆酶均有较好的稳定性，但其中一株MF-01的性能更加突出，并且能够稳定遗传，分析是突变剂使其产漆酶的基因序列发生了变化。
　　为了验证这一猜想，实验用RACE的方法对未突变菌株的产漆酶基因进行了克隆，得到了产漆酶基因的编码区全部序列，并以此基因设计引物，对突变菌株的产漆酶基因编码区进行克隆，对两段基因对比发现，在编码区的第1522bp左右的位置，有碱基发生了变，由GCT变成了GAT，致使其编码的氨基酸由丙氨酸变成了天冬氨酸，突变并没有对漆酶的铜中心造成结构变化。铜中心是一个相对保守的区域，活性中心的铜离子位点就位于这个由1个半胱氨酸和10个组氨酸残基构成的配体结构中。丙氨酸为中性氨基酸，而转变为天冬氨酸后，变成了带负电荷的酸性氨基酸，组氨酸属于带正电荷碱性氨基酸；分析这两种氨基酸可能产生了分子间作用力，使漆酶蛋白分子更加稳定，但漆酶不仅由氨基酸组成，还有糖基的参与，分析稳定性的变化还有可能是诱变使糖基化过程发生了某些变化，本文仅在漆酶基因水平上做了基础性研究。

目录

1 绪论

1.1 漆酶的介绍

1.2 真菌漆酶的结构和催化反应机制

1.3 获得产稳定性能好漆酶菌株的有效途径

1.4 漆酶的性质

1.5 漆酶的分子生物学研究

1.6 c DNA 末端快速扩增 (RACE) 技术

1.7 研究目的和意义

2 产耐高温漆酶菌株的筛选和研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

3 漆酶相关基因的克隆

3.1 漆酶相关基因3' RACE片段克隆

3.2 漆酶相关基因5' RACE片段克隆

3.3 结果分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 基因克隆结果与生物信息分析

4.1 MF-01基因的获得

4.2 结果分析

4.3 生物信息学分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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