拟南芥Trihelix转录因子AST1调控植物抗旱、耐盐的机制研究

摘要

Trihelix转录因子因其DNA结构域中含有一个（螺旋-环-螺旋-环-螺旋-环）的保守区域而得名，并且Trihelix家族蛋白能够识别光应答GT元件，虽然其在盐、旱和光等胁迫应答过程中都起重要调控作用。然而只有少数Trihelix基因的功能被鉴定。本研究克隆了一个Trihelix家族基因，命名为AST1(Arabidopsis SIP1clade Trihelix1，AT3G24860)，并探讨了其响应非生物胁迫的抗逆机理。
　　(1)首先构建PBI121-ProAST1-GUS载体，然后通过拟南芥花絮侵染的方法获得稳定转基因苗。通过GUS染色分析AST1基因在不同发育阶段和组织器官中的表达，发现随着植物的生长，AST1基因的表达量不断上升，当植物开始抽茎后，AST1基因的表达量降低。GUS染色和定量PCR共同分析发现AST1基因在叶片、花和茎中的表达量要高于根和果荚。qRT-PCR分析发现，经过NaCl和Mannitol诱导后，AST1能够响应盐和渗透胁迫。将PBI121-ProAST1-GUS苗用NaCl和Mannitol处理后，通过GUS染色和GUS酶活测定发现AST1基因在非生物胁迫诱导后的表达量显著上升。亚细胞定位分析表明AST1蛋白定位于细胞核。
　　(2)通过蘸花法转化获得稳定表达AST1的转基因拟南芥，同时，筛选获得了AST1纯合突变体株系，通过与野生型拟南芥和转pROK2空载转基因拟南芥的比较发现，在NaCl和Mannitol胁迫后，AST1的表达能够显著提高植物的抗逆性。进一步研究发现，AST1主要通过负调控气孔的开度而减少水分的蒸发，维持K+/Na+离子平衡，调控脯氨酸的合成，减少细胞的损伤及增强植物清除活性氧的能力等方式调控其抗逆能力。通过实时定量PCR发现，AST1能够调控气孔调节基因AtMYB61，Na+(K+)/H+转运蛋白基因，脯氨酸合成和降解基因，SODs、PODs和LEA家族抗逆基因的表达，从而调控植物的抗旱、耐盐能力。
　　(3)渗透胁迫处理下，比较了AST1过表达和突变体植株的转录组分析，发现共有144个差异表达基因，其中有65个为上调表达基因，77个为下调表达基因，并且通过GO分析发现差异基因主要参与刺激响应，信号转导，免疫响应等生物过程。利用MEME软件对实时定量PCR和转录组中上调表达基因的启动子序列进行保守区域预测，找到一段12bp长的保守序列，并通过酵母单杂交，植物体内AST1与元件互作分析，EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)和ChIP(Chromatin immunoprecipitation)等实验找到AST1识别的核心序列为[A/G][G/A][A/T]GAGAG，命名为AGAG-box。另外通过酵母单杂交、EMSA和ChIP等实验证实，AST1能够识别一些GT元件，包括GGTAATT，TACAGT，GGTAAAT and GGTAAA，但是不能识别GTTAC和GGTTAA。同时通过ChlP-qPCR发现，AST1通过识别AGAG-box和GT元件来调控AtMYB61，P5CS1、P5CS2、HKT1、NHX2、NHX3、NHX6、SODs、PODs和LEA等抗逆基因的表达。
　　综上所述发现，AST1转录因子通过结合一个新的元件AGAG-box和一些GT元件来调控非生物胁迫响应基因，从而调控细胞离子平衡，维持细胞渗透压，减少水分的蒸发、减少细胞的死亡及提高ROS清除能力等，提高植物对逆境的耐受性，深入揭示了AST1基因的抗逆机制。

目录

摘要

1．1 引言

1．2 植物抗逆研究状况

1．2．1 植物逆境的概念

1．2．2 生物胁迫

1．2．3 非生物胁迫

1．2．4 生物胁迫与非生物胁迫间的联系

1．3 抗逆相关转录因子的研究状况

1．3．1 转录因子的结构与抗逆功能研究

1．3．2 转录因子在非生物胁迫中的调控途径

1．3．3 转录因子与DNA互作的研究方法

1．4 植物Trihelix转录因子的研究进展

1．4．1 Trihelix转录因子的结构特征及生物功能

1．4．2 Trihelix转录因子对逆境胁迫的响应能力

1．4．3 Trihelix转录因子所识别的顾式作用元件

1．5 研究的目的和意义

2 拟南芥AST1的时空表达模式及亚细胞定位

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 培养基及药品的配置

2．2 实验方法

2．2．1 GUS染色分析AST1的组织特异性表达

2．2．2 盐和渗透胁迫下，qRT-PCR分析AST1基因的表达模式

2．2．4 AST1蛋白的亚细胞定位

2．3 结果与分析

2．3．1 AST1基因的组织特异性表达

2．3．2 盐和渗透胁迫处理下，AST1基因的表达

2．3．3 AST1蛋白的亚细胞定位

2．4 本章小结与讨论

3 拟南芥AST1基因的抗逆功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株与载体

3．1．3 主要试剂

3．1．4 培养基及药品的配置

3．2 实验方法

3．2．1 AST1过表达载体的构建及转基因植株鉴定

3．2．2 纯合突变体植株的筛选

3．2．3 盐和渗透胁迫下，AST1基因抗逆生理分析

3．3 结果与分析

3．3．1 AST1过表达株系及纯合突变体的获得

3．3．2 AST1提高了植物的抗逆性

3．3．3 应对非生物胁迫AST1负向调控气孔的关闭

3．3．4 应对非生物胁迫AST1对Na+和K+平衡的调控分析

3．3．5 盐和渗透胁迫下细胞膜损伤分析

3．3．6 应对非生物胁迫AST1提高植物对活性氧的清除能力

3．3．7 应对非生物胁迫AST1对脯氨酸合成调控分析

3．3．8 应对非生物胁迫AST1对海藻糖的合成调控分析

3．3．9 LEA家族基因在不同株系的表达

3．4 本章小结和讨论

4 拟南芥AST1识别的顺式作用元件及对下游基因的表达调控分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株与载体

4．1．3 主要试剂

4．1．4 培养基及药品的配置

4．2 实验方法

4．2．1 转录组分析

4．2．2 AST1基因作用元件预测

4．2．3 酵母单杂交实验验证AST1基因与元件的结合

4．2．4 GUS酶活验证AST1与元件的互作分析

4．2．5 EMSA分析AST1对元件的识别

4．2．6 ChIP分析AST1对元件的识别及对基因的调控

4．3 结果与分析

4．3．1 AST1过表达与突变体植株的差异表达基因分析

4．3．2 AGAG-box顺式作用元件的预测及识别验证

4．3．3 AST1对GT元件的识别及验证

4．3．4 盐和渗透胁迫下AST1基因对下游基因的表达调控

4．4 本章小结与讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

附录

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