白桦早衰突变体的鉴定与研究

摘要

衰老是植物生长发育的重要生命过程，通过衰老的发生，植物可以自我保护和抵抗不良外界环境。衰老的调控机制非常复杂，而早衰突变体的发现为人们研究衰老的机制提供了理想的工具。本实验室在研究白桦（Betula platyphylla×B.pendula）BpGH3.5基因时，获得了21个超表达株系，其中有一个株系叶片表面逐渐长有褐色的斑点，叶片提前脱落，表现为早衰的表型，命名为lmd(Lesion mimic and defoliation)株系。选取突变株系lmd、转基因对照G21株系、野生型对照WT株系进行了植株生长、光合生理、细胞结构、组织化学染色、相关酶类活性变化、抗病性等方面的研究。实验结果表明，lmd株系的株高、地径和净光合速率均显著低于两个对照株系，而其他的光合指标和叶绿素荧光参数与两个对照株系相比并无显著差别。实体显微镜观察发现lmd株系第4叶开始，叶片表面出现褐色斑点，并且斑点的数目随着叶龄的增加而逐渐增加，但其大小并未发生改变。石蜡切片结果表明褐色斑点处的细胞已经死亡，Evans blue染色结果表明lmd株系叶片死亡细胞数目显著多于两个对照。细胞超微结构观察发现lmd株系叶片细胞出现自噬体，细胞器逐渐消失，死亡细胞残留有细胞壁结构。3，3一二氨基联苯胺(DAB)染色结果表明，在lmd株系叶片中，除了第1叶因过小而难以观察外，从第2至第5叶均积累了大量的过氧化氢(H2O2)。扫描电镜观察发现lmd株系叶片表面的叶腺结构退化较两个对照株系早，而其过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性高于两个对照，丙二醛(MDA)含量高于两个对照，叶片维管束出现明显的胼胝质积累，这些都证明lmd株系叶片具有早衰的表现。另外，还做了lmd株系抗病性的研究，结果发现lmd株系对Alternaria alternate(Fr.)Keissler抗病性显著增强。
　　转录组测序结果表明，lmd株系叶片的基因表达发生了明显的变化。综合分析lmd、G21和WT成熟叶片之间差异基因的情况，找到995个与lmd突变株早衰形成有重要关系的差异表达基因，其中560个基因上调表达，435个基因下调表达。对这些差异基因进行分析发现，与植物防御反应（对真菌的防御反应、对细菌的防御反应）、激素代谢和信号转导（水杨酸响应途径、生长素激活信号途径、茉莉酸和乙烯信号途径）、细胞死亡、细胞对过氧化氢的反应、氧还反应过程等GO(Gene Ontology)条目均显著富集。
　　Southern blot结果表明在lmd突变株基因组中有两个T-DNA插入位点。采用基因组重测序和TAIL-PCR两种方法对T-DNA插入位点进行确定。结果表明，一个插入位点在BpEIN3基因上游598bp处，另一插入位点为基因间隔区。实时荧光定量PCR结果表明白桦早衰突变株lmd中BpEIN3基因的相对表达量显著低于G21和WT两个对照。对BpEIN3基因启动子的元件分析表明，其启动子上有很多与植物抗病性、激素信号转导等相关的元件，预示了该基因在乙烯与不同激素之间相互作用的重要功能。构建了BpEIN3基因启动子、超表达和抑制表达载体，并对白桦合子胚进行了遗传转化，获得了相应的转基因株系，其中BpEIN3基因启动子转基因株系7个、BpEIN3基因超表达转基因株系5个、抑制表达株系10个，经PCR检测均为阳性。转白桦BpEIN3基因启动子的转基因植株经过GUS染色，结果表明，该基因主要在白桦的成熟叶片中表达，幼叶、茎和根中的表达量则较少。白桦BpEIN3抑制表达株系SE-11株系的叶片表现出于lmd株系相似的性状，包括株高和地径较小、净光合速率较低、叶片表面长有褐色斑点以及叶片脱落较早、叶片组织有H2O2积累等性状，初步验证了白桦BpEIN3基因对白桦早衰发生的作用。本研究为揭示白桦叶片早衰的发生以及细胞程序化死亡分子机理奠定了基础，为其他木本植物衰老相关研究提供了参考。

目录

摘要

1 结论

1．1 影响植物叶片衰老的因素

1．1．1 叶片衰老的外部因素

1．1．2 叶片衰老的内部因素

1．3 植物衰老的分子机理

1．3．1 叶片衰老的多水平调控

1．3．2 植物衰老相关基因

1．4 EIN3／EILs转录因子家族研究进展

1．4．1 EIN3／EILs参与乙烯信号转导

1．4．2 EIN3／EILs与植物的抗逆性有关

1．4．3 EIN3／EILs调节乙烯与其它激素的交叉对话

1．5 本研究的目的与意义

2 白桦早衰突变体的特征

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 供试菌种

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 株高和地径的调查

2．2．2 光合速率和叶绿素荧光参数的测定

2．2．3 叶片表面超微结构的观察

2．2．4 石蜡切片的制备与观察

2．2．5 叶片超微结构的观察

2．2．6 组织化学染色

2．2．7 POD、SOD及MDA的测定

2．2．8 抗病性观察

2．3 实验结果

2．3．1 lmd、G21、WT株系生长性状比较

2．3．2 lmd、G21、WT株系光合特性和叶绿素荧光参数比较

2．3．3 lmd、G21、WT株系叶片表面超微结构观察

2．3．4 lmd、G21、WT株系叶片组织解剖结构的观察

2．3．5 lmd、G21、WT株系叶片超微结构观察

2．3．6 组织化学染色

2．3．7 POD、SOD、MDA测定

2．3．8 lmd、G21、WT株系抗病性分析

2．4 本章小结

3 白桦早衰形成相关基因表达的分析

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 RNA的提取与反转录

3．2．2 RNA文库的构建及测序

3．2．3 转录组文库质量评估

3．2．4 基因表达量及差异基因分析

3．2．5 qRT-PCT方法验证表达谱测序结果

3．2．6 内源激素含量的测定

3．3．1 RNA的获得

3．3．2 测序数据统计与评估

3．3．3 转录组测序文库质量评估

3．3．4 差异表达基因数目统计

3．3．5 lmd、G21和WT 3个株系功能叶片差异基因分析

3．3．6 基因共表达分析

3．3．7 qRT-PCR验证

3．3．8 lmd突变株早衰分子机制分析

3．4 本章小结

4 T-DNA插入位点侧翼序列分析

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 白桦总DNA的提取

4．2．2 Southern杂交

4．2．3 早衰突变体lmd基因组重测序

4．2．4 TAIL-PCR

4．3 实验结果

4．3．1 白桦总DNA的获得

4．3．2 T-DNA插入位点数的确定

4．3．3 lmd突变株基因组重测序分析

4．3．4 T-DNA插入位点的侧翼序列的获得

4．3．5 插入位点的验证

4．4 本章小结

5 白桦BpEIN3基因功能初步研究

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 载体与菌株

5．2．1 BpEIN3启动子的生物信息学分析

5．2．2 BpEIN3启动子的克隆及表达载体构建

5．2．3 BpEIN3基因克隆及过表达载体构建

5．2．4 BpEIN3基因抑制表达载体构建

5．2．5 工程菌的制备及遗传转化

5．2．6 转基因植株的PCR检测及基因定量分析

5．2．7 BpEIN3启动子的活性分析

5．2．8 转基因植株的表型观察

5．3 结果与分析

5．3．1 BpEIN3启动子序列顺式作用元件分析

5．3．2 BpEIN3启动子的克隆及表达载体构建

5．3．3 BpEIN3基因的克隆及表达载体构建

5．3．4 BpEIN3基因抑制表达载体构建

5．3．5 转基因植株的PCR及qRT-PCR检测

5．3．6 BpEIN3启动子的活性分析

5．3．7 转基因植株的表型观察

5．4 本章小结

6 讨论与结论

6．1 讨论

6．1．1 植物叶片衰老与细胞程序性死亡

6．1．2 植物叶片早衰与抗病性的关系

6．1．3 植物叶片衰老与基因表达

6．2 结论

6．3 展望

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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