猫免疫缺陷病毒p24蛋白的表达及免疫原性分析

摘要

猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus，FIV)和人类免疫缺陷病毒同属反转录病毒科，慢病毒属成员，主要引起猫科动物的免疫缺陷疾病。感染了猫免疫缺陷病毒的个体可以在数年内无任何症状，在其发病初期主要表现为发热、腹泻、淋巴结肿大、白细胞中的中性粒细胞减少、口腔炎症、鼻炎、食欲不振及体型瘦弱。FIV感染发生在全世界范围，自1985年首次发现以来，已在美国、日本、加拿大等国流行。猫艾滋病病毒有较强突变性，不同地区分离的毒株均有差异。本实验以猫免疫缺陷病毒阳性全血所提DNA为材料，对FIV gag基因p24片段进行分子克隆、原核及真核表达和多克隆抗体制备，为后期FIV血清学检测方法的建立奠定一定基础。本实验取得结果如下:
　　根据GenBank上猫免疫缺陷病毒全基因RNA序列(Accession:NC_001482.1)，设计了p24蛋白编码区的一对引物，首先从血清学检测为阳性的猫血液样本中提取总RNA经反转录成cDNA后，再利用PCR方法扩曾p24基因，成功获得了622bp的目的片段，编码207个氨基酸，经测序后与GenBank提供的序列同源性达到98％。亚克隆后酶切及PCR验证正确后将带粘性末端的目的片段连接到表达载体pET-28a(+)，成功构建pET-28a-p24重组原核表达质粒。重组质粒转化BL21(DE3)，经SDS-PAGE和免疫印迹(Western-blot)鉴定显示重组蛋白主要以包涵体形式表达，且能够与抗His标签小鼠单克隆抗体发生反应，证明本实验构建的原核表达载体能够成功表达p24蛋白。
　　原核表达重组菌经过大量诱导表达后，利用切胶电洗脱纯化获得p24蛋白，纯化的p24蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混合后对小鼠进行腹腔注射。之后用弗氏不完全佐剂混合纯化蛋白进行另外三次加强免疫，总共四次免疫后获得了具有较高特异性的多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测多克隆抗体效价，结果显示效价可达1∶51200。
　　为了能够将目的片段连接到pCMV-HA真核表达载体，需要设计一组具有不同酶切位点的引物。将亚克隆鉴定正确的目的片段连接到pCMV-HA载体，构建p24基因真核表达载体pCMV-HA-p24。通过脂质体介导法将重组质粒转染到HEK-293T细胞中。经空载体转染的HEK-293T细胞作为对照组，Western-blot方法检测p24蛋白的免疫学活性。此部分实验成功构建pCMV-HA-p24真核表达载体，构建正确的重组质粒经脂质体介导转染HEK293T细胞，免疫荧光检测结果显示筛选出的HEK-293T-p24细胞系大多数细胞能够显示绿色荧光而作为对照的HEK-293T细胞则不显示荧光，能够说明p24蛋白在HEK-293T-p24细胞系中成功且高效表达。真核表达的特点是所表达的蛋白一旦表达成功即拥有相应的生物学活性，所以真核表达的p24蛋白在本实验用作检测鼠源多克隆抗体特异性的检测蛋白。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．1．1 猫艾滋病简介

1．1．2 FIV的分子生物学研究进展

1．1．3 FIV的诊断方法研究进展

1．1．4 猫免疫缺陷病的预防和控制

1．2 选题的目的与意义

2 实验材料方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验主要商品化试剂

2．1．3 实验相关试剂的配制方法

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 FIV p24片段的克隆及原核表达

2．2．2 多克隆抗体的制备

2．2．3 p24蛋白的真核表达

3 实验结果

3．1．1 目的片段的获取与亚克隆

3．1．2 原核表达重组质粒的酶切鉴定

3．1．3 P24蛋白的原核表达

3．2 多克隆抗体的制备

3．3．1 目的片段的扩增

3．3．2 克隆重组质粒的酶切鉴定

3．3．3 去内毒素重组质粒的酶切鉴定

3．4 真核表达p24蛋白间接免疫荧光法检测多克隆抗体

3．5 本章小结

4 讨论

4．1 主要慢病毒的gag蛋白、p24蛋白的表达和应用

4．2 FIV的相关疫苗研发

4．3 FIV p24免疫原性的研究

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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