磁性固定化可食用菌生物转化三七中Rb1到Rd以及Rg3的研究

摘要

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)是一种著名的中草药材，是五加科人参属植物。皂苷是三七的主要活性成分，其中皂苷成分主要包括Rb1、Rb2、Rd、Rg3等多种，具有很好的药理作用。其中在三七根部中二醇组皂苷Rb1(＞20％)的含量较其他皂苷类成分相对高，而Rd(＜6％)和Rg3(＜0.4％)等人参稀有皂苷虽然含量极低，但药理学研究表明稀有皂苷具有抗肿瘤、抑制癌细胞转移、促进癌细胞凋亡的活性等功效而越来越被广泛应用。三七中的天然人参皂苷需在体内代谢转化为小极性皂苷，才能发挥药理活性。由于体内转化受诸多个体因素影响，转化甚微。通过各种方法获得小极性人参皂苷越来越受到人们的重视，微生物转化法由于反应选择性强、反应条件温和、环境兼容性好更具优势，但发酵过程多采用固体发酵，成本高、耗时长、菌种与产物难分离。
　　基于以上问题，本研究制备了一种新型磁性固定化微生物用于三七皂苷活性成分Rb1到Rd以及Rg3的生物转化，对新型磁性纳米粒子进行了表征，筛选并构建了用于三七皂苷生物转化可食用菌体系，同时优化可食用菌磁性固定化工艺，并建立了磁性固定化可食用菌生物转化三七皂苷发酵工艺。
　　主要研究内容和结论包括三个方面:
　　1.筛选并构建了用于三七皂苷生物转化的可食用菌体系
　　本实验以三七为原料，以Rb1，Rd以及Rg3的含量为指标，从七株可食用内生真菌中筛选出对其转化能力最强的，转化产物Rd以及Rg3含量最高的一株菌。转化三七皂苷的优化菌种为黑曲霉(Asp.niger3.3883)和米曲霉(Asp.oryzae3.591)，应用优化的菌种转化后，Rd以及Rg3含量分别达到了41.35±0.12mg/g和6.35±0.08mg/g，与原药材对比分别提高了6.97倍和3.23倍。
　　2.优化并建立了磁性固定化可食用菌筛选体系
　　本实验选用海藻酸钠并加入磁性纳米粒子包埋法固定化可食用菌，以固定化后的菌球酶活力为指标，考察了磁性固定化方法对菌球酶活力的影响，优化并确定了磁性纳米粒子的浓度、菌液浓度、海藻酸钠浓度、氯化钙浓度等固定化工艺参数。
　　生物转化三七皂苷的菌球固定化条件为:磁性纳米粒子浓度0.25％、海藻酸钠浓度7％、氯化钙浓度2％、菌液浓度7.4log cfu/mL;在此工艺条件下所获得的固定化菌酶活力可达1.4U/g.
　　通过固定化菌稳定性实验研究，与之前未加入磁性纳米粒子的菌球相比，制备的磁性固定化菌球使用次数可达15次以上，在使用第15次时，酶活力可达83.8％，证明加入磁性纳米粒子后固定化菌球的稳定性有了很大的提升，适合重复利用和规模化生物转化的需要。
　　3.建立了磁性固定化可食用菌制备及其稳定性的考察
　　本实验以Rd和Rg3的含量为指标，采用单因素实验及中心组合设计实验，进一步利用响应面分析，确定了磁性固定化菌生物转化三七皂苷Rd和Rg3的最佳发酵工艺参数，得到最佳条件为:pH6.5，温度32℃，时间48h。在此最佳条件下，Rd的产量达到41.35mg/g，Rg3的产量达到6.35mg/g，分别是原药材含量的6.97倍和3.23倍。
　　对发酵前后的样品进行扫描电镜，与未加磁性的固定化样品相比较，表明经磁性固定化的样品表面结构破坏更加严重，活性成分溶出更多，从植物组织形态学角度进一步证明的磁性固定化菌球对三七皂苷的转化更加有效。
　　在最佳转化发酵工艺下，创新型的将磁性纳米粒子与生物转化技术相结合，可以更有效的获得目标产物Rd以及Rg3。此方法具有成本低、生产效率高、绿色环保等优点，更重要的是可以实现目标化合物高效的转化以及产物与底物得到快速高效的分离，对工业上生产三七皂苷具有重大的意义。

目录

摘要

1 绪论

1．1 三七概述

1．1．1 三七中化学成分的研究

1．2 三七皂苷的药理活性

1．3 三七皂苷的制备方法

1．3．1 酶转化法

1．3．2 微生物转化法

1．4 固定化技术及其在微生物转化方面的应用

1．4．1 固定化微生物方法比较

1．4．2 固定化技术的应用进展

1．5 磁性载体

1．5．1 磁性载体简介

1．5．2 磁性载体制备方法

1．5．3 磁性载体在固定化方面的应用

1．6 研究目的、意义

2 可食用菌的筛选

2．1．1 实验主要仪器

2．1．2 实验材料与试剂

2．1．3 马铃薯培养基的制备

2．2 实验步骤与方法

2．2．1 三七转化菌种的筛选

2．2．2 菌种培养

2．2．3 分析方法

2．2．4 统计学处理

2．3 结果与讨论

2．3．1 三七中对Rd和Rg3转化率高的菌株的筛选

2．3．2 混合菌株的筛选

2．4 本章小结

3 磁性固定化可食用菌制备及其稳定性

3．1．1 培养基的配制

3．1．2 主要仪器

3．1．3 实验材料及药品

3．2．1 磁性固定化可食用菌转化三七皂苷

3．2．2 非磁性、磁性固定化可食用菌，游离菌三者之间酶活力大小的比较

3．2．3 固定化条件的优化

3．2．4 磁性固定化菌球活力稳定性研究

3．2．5 统计学处理

3．3 结果与讨论

3．3．1 磁性固定化菌、非磁性固定化菌以及游离菌之间酶活力的比较

3．3．2 固定化条件单因素优化

3．3．3 磁性固定化菌球活力稳定性研究

3．4 本章小结

4 磁性固定化食用菌生物转化三七发酵工艺优化

4．1．1 培养基的配制

4．1．2 主要仪器

4．1．3 实验材料以及试剂

4．2．1 药用植物转化基质的制备

4．2．2 固定化菌球的制备

4．2．3 磁性固定化菌生物转化三七皂苷的发酵

4．2．4 三七中三七皂苷的提取分离

4．2．5 三七中三七皂苷定量分析检测

4．2．6 磁性固定化菌生物转化三七皂苷发酵条件优化

4．2．7 扫描电镜观察

4．2．8 统计学分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 磁性固定化微生物转化三七皂苷工艺条件单因素优化

4．3．2 中心组合设计与响应面优化三七皂苷的生物转化

4．3．3 扫描电镜的观察(SEM)

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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