固定化可食用菌生物转化四种药用植物活性成分研究

摘要

本研究筛选并构建了用于四种药用植物活性成分生物转化可食用菌体系同时优化并建立了可食用菌生物转化固定化工艺。在确定固定化工艺后，建立了固定化可食用菌生物转化药用植物发酵工艺并评估了固定化可食用菌生物转化药用植物的抗氧化活性。最后，进行了固定化菌生物转化药用植物中试实验验证。
　　主要结论如下:
　　1.筛选并构建了用于四种药用植物活性成分生物转化的可食用菌体系
　　本实验以四种药用植物虎杖、木豆根、槐角、牛蒡子为原料，以白藜芦醇、染料木素、染料木素和牛蒡子苷元的含量为指标，筛选出对四种植物药材生物转化能力强的菌。
　　转化虎杖的优化菌种为酵母菌(Yeast CICC1912)和黑曲霉(Aspergillus niger M85)，应用优化的菌种转化后白藜芦醇含量由原药材中的3.04 mg/g增加到14.57 mg/g。
　　转化木豆根的优化菌种为红曲霉(Monascus anka3.782)和米曲霉(Aspergillus oryzae3.951)，应用优化的菌种转化后染料木素含量由原药材中的0.76 mg/g增加到1.24mg/g。
　　转化槐角的优化菌种为米曲霉(Aspergillus oryzae Y29)和酵母菌(Yeast JB)，应用优化的菌种转化后染料木素含量由原药材中的27.8 mg/g增加到32.9 mg/g。
　　转化牛蒡子的优化菌种为黑曲霉(Aspergillus niger M85)和红曲霉(Monascus anka3.554)，应用优化的菌种转化后牛蒡子苷元含量由原药材中的18 mg/g增加到38 mg/g。
　　2.优化并建立了可食用菌生物转化固定化工艺
　　本实验选用海藻酸钠包埋法固定化可食用菌，以固定化后的菌球酶活力为指标，考察了固定化方法对菌球酶活力的影响，优化并确定了菌液浓度、海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、固定化菌菌球直径等固定化工艺参数。
　　生物转化虎杖的菌球固定化条件为:海藻酸钠浓度5％、氯化钙浓度2.5％，菌液浓度7.2 log cfu/mL、菌球直径4mm;在此工艺条件下所获得的的固定化菌酶活力可达1.40 U/g。
　　生物转化木豆根菌球的固定化条件为:海藻酸钠浓度6％、氯化钙浓度3％，菌液浓度7.1 log cfu/mL、菌球直径4mm;在此工艺条件下所获得的的固定化菌酶活力可达1.03 U/g。
　　生物转化槐角的菌球固定化条件为:海藻酸钠浓度6％、氯化钙浓度3.5％，菌液浓度7.1 log cfu/mL、菌球直径5mm;在此工艺条件下所获得的的固定化菌酶活力可达0.94 U/g。
　　生物转化牛蒡子菌球的固定化条件为:海藻酸钠浓度7％、氯化钙浓度2.5％，菌液浓度7.4 log cfu/mL、菌球直径4mm;在此工艺条件下所获得的的固定化菌酶活力可达1.31 U/g。
　　通过固定化菌稳定性实验研究，制备的四种固定化菌使用次数均可达15次以上，证明固定化菌的稳定性较好，适合重复利用和规模化生物转化的条件需求。
　　3.建立了固定化可食用菌生物转化药用植物发酵工艺
　　本实验以虎杖、木豆根、槐角、牛蒡子四种药用植物的活性成分为指标，采用单因素实验及中心组合设计实验，进一步利用响应面分析，确定了固定化菌生物转化四种药用植物中天然活性成分的最佳发酵工艺参数，分别如下:
　　生物转化虎杖最优条件为:pH6.5，温度30℃，时间2d，固液比1∶12 g/mL。在此条件下，白藜芦醇的产量可达33.45 mg/g，是虎杖原药材中白藜芦醇含量(3.04 mg/g)的11倍;
　　生物转化木豆根最优条件为:时间2d，温度30℃，pH6.2，固液比1∶12 g/mL。在此优化条件下，染料木素的产量为1.87 mg/g，是木豆根原药材中染料木素含量(0.71mg/g)的2.65倍。
　　生物转化槐角最优条件为:pH5，液固比25∶1(mL/g)，时间24 h，菌球重量与药材重量比10 g/g。在此条件下，染料木素的产量可达18.95 mg/g，是槐角原药材中染料木素含量(0.55 mg/g)的34倍;
　　生物转化牛蒡子最优条件为:时间48 h，温度32℃，pH6.5，固液比1∶15 g/mL。在此条件下，牛蒡子苷元的产量可达41.01 mg/g，是牛蒡子原药材中牛蒡子苷元含量(6.87 mg/g)的5.97倍。
　　比较四种药用植物发酵前后的扫描电镜图，表明经固定化菌发酵的样品表面结构破坏严重。从植物组织形态学角度验证了固定化菌对药用植物的有效转化。
　　4.评估了固定化可食用菌生物转化药用植物的抗氧化活性
　　本实验对虎杖、木豆根、槐角和牛蒡子进行固定化菌生物转化，并对转化后粗提取物通过DPPH清除自由基实验、β-胡萝卜素漂白实验进行抗氧化活性评估，综合评价药用植物抗氧化能力。
　　通过DPPH自由基清除实验和β-胡萝卜素漂白实验可知，虎杖发酵前IC50值为0.10±0.14、0.43±0.35(mg/mL)，发酵后IC50值为0.074±0.27、0.19±0.27(mg/mL);木豆根发酵前IC50值为1.117±0.04(mg/mL)、0.216±0.16(mg/mL)，发酵后IC50值为0.737±0.06(mg/mL)、0.173±0.02(mg/mL);槐角，发酵前IC50值为0.34±0.08、0.41±0.24(mg/mL)，发酵后IC50值为0.31±0.13、0.35±0.08(mg/mL);牛蒡子发酵前IC50值为0.43±0.16、0.64±0.33(mg/mL)，发酵后IC50值为0.27±0.05、0.43±0.24(mg/mL)。
　　实验结果表明，与未处理药用植物相比，经固定化菌发酵后的药用植物具有更加显著的抗氧化活性。
　　5.进行了固定化菌生物转化药用植物中试实验验证
　　应用本研究设计并制作的中试转化装置分别发酵四种植物药材，利用固定化菌生物转化植物药材中天然活性成分。
　　虎杖中白藜芦醇32.78±0.34 mg/g，相比于转化前提高了10.78倍。木豆根中染料木素含量为1.71±0.10 mg/g，相比于转化前提高了2.41倍。槐角中染料木素17.84±0.89 mg/g，相比于转化前提高了32.44倍。牛蒡子中牛蒡子苷元40.19±0.37 mg/g，相比于转化前提高了5.85倍。通过抗氧化实验检测，表明中试装置转化后四种药材粗提物抗氧化活性优于原药材。
　　通过使用固定化菌生物转化装置进行中试实验验证，实现了连续投料，连续生物转化生产，为大规模产业化生产提供了数据支持，为固定化菌的利用技术提供了新的途径。

目录

摘要

1 绪论

1．1 微生物转化综述

1．1．1 微生物转化的研究背景

1．1．2 微生物转化的概念及特点

1．1．3 微生物转化的应用

1．2 固定化微生物技术简介及其在生物转化方面的应用

1．2．1 固定化微生物技术简介

1．2．2 固定化微生物的制备

1．2．3 固定化载体的特征分类及固定化微生物技术的特点

1．2．4 固定化微生物反应器

1．2．5 固定化微生物技术的应用研究进展

1．3 四种用于微生物转化的药用植物简介

1．3．1 虎杖

1．3．2 木豆

1．3．3 牛蒡子

1．3．4 槐角

1．4 药用植物活性成分体外抗氧化检测方法简介

1．4．1 DPPH法

1．4．2 羟基自由基清除能力法

1．4．3 ABTS法(SABTS assay)

1．4．4 铁离子还原／抗氧化能力测定法(Ferric reducing antioxidant power，FRAP)

1．4．5 β-胡萝卜素漂白法(β-carotene bleaching assay)

1．4．6 邻苯三酚自氧化法(Pyrogallol autoxidation)

1．5 课题研究的目的与意义

2 可食用菌的筛选、培养、固定化

2．1 实验仪器与实验材料

2．1．1 药材来源及主要培养基及试剂的配制

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．2 实验步骤与方法

2．2．1 药用植物转化菌种的筛选

2．2．2 菌种培养

2．2．3 分析方法

2．2．4 统计学处理

2．3 结果与讨论

2．3．1 高产虎杖中白藜芦醇菌株的筛选

2．3．2 高产木豆根中染料木素菌株的筛选

2．3．3 高产槐角中染料木素的菌株筛选

2．3．4 高产牛蒡子中牛蒡子苷元的菌株筛选

2．4 本章小结

3 可食用菌生物转化固定化条件优化及稳定性

3．1 实验仪器与材料

3．1．1 主要培养基的配制

3．1．2 主要仪器

3．1．3 实验材料及药品

3．2 实验步骤与方法

3．2．1 固定化可食用菌生物转化药用植物

3．2．2 固定化菌和游离菌活力的比较

3．2．3 固定化条件单因素优化

3．2．4 固定化菌球活力稳定性研究

3．2．5 统计学处理

3．3 结果与讨论

3．3．1 微生物转化药用植物虎杖固定化条件的优化及稳定性研究

3．3．2 微生物转化木豆根菌球固定化条件的优化及稳定性研究

3．3．3 微生物转化槐角固定化条件的优化及稳定性研究

3．3．4 微生物转化牛蒡子固定化条件的优化及稳定性研究

3．4 本章小结

4 固定化菌生物转化药用植物发酵条件的优化

4．1 实验仪器与材料

4．1．1 主要培养基的配制

4．1．2 主要仪器

4．1．3 实验材料及药品

4．2 实验步骤与方法

4．2．1 药用植物生物转化基质的制备

4．2．2 固定化菌球的制备

4．2．3 固定化菌生物转化药用植物发酵过程

4．2．4 药用植物中天然产物提取分离

4．2．5 药用植物中有效成分定量分析与检测

4．2．6 固定化菌生物转化药用植物发酵条件优化

4．2．7 扫描电镜观察

4．3 统计学处理

4．4 结果与讨论

4．4．1 固定化菌生物转化药用植物发酵条件的优化

4．4．2 固定化菌生物转化虎杖的发酵条件单因素优化

4．4．3 中心组合设计与响应面优化虎杖中白藜芦醇的含量

4．4．4 固定化菌生物转化木豆根的发酵条件单因素优化

4．4．5 中心组合设计与响应面优化木豆根中染料木素的含量

4．4．6 固定化菌生物转化槐角的发酵条件单因素优化

4．4．7 中心组合设计与响应面优化槐角中染料木素的含量

4．4．8 固定化菌生物转化牛蒡子的发酵条件单因素优化

4．4．9 中心组合设计与响应面优化牛蒡子中牛蒡子苷元的含量

4．4．10 扫描电镜观察(SEM)

4．5 本章小结

5 固定化菌生物转化药用植物的抗氧化活性检测

5．1 实验仪器与材料

5．1．1 菌种

5．1．2 原料

5．1．3 主要仪器

5．1．4 实验材料及药品

5．2 实验步骤与方法

5．2．1 抗氧化活性的测定

5．2．2 统计学处理

5．3 结果与讨论

5．3．1 药用植物抗氧化活性检测

5．4 本章小结

6 固定化菌生物转化药用植物中试验证实验

6．1 材料与方法

6．1．1 主要培养基的配制

6．1．2 主要仪器

6．1．3 药品及试剂

6．1．4 实验装置

6．2 实验步骤与方法

6．2．1 植物药材生物转化基质的制备

6．2．2 固定化菌球的制备

6．2．3 固定化反应器发酵过程

6．2．4 样品的制备与检测

6．2．5 样品抗氧化活性的检测

6．3 结果与讨论

6．3．1 液相检测分析

6．3．2 抗氧化活性分析

6．4 本章小结

结论

参考文献

致谢

声明