人肺腺癌细胞株A549中热休克蛋白70的分离及纯化

摘要

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近数十年肺癌的发病率和死亡率均有明显增高的趋势。因此，寻找切实可行的治疗方案已成为目前迫切需要解决的问题之一。 近年来的研究发现与肿瘤特异性抗原多肽结合的HSP70能够引发肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应，有望以HSP70多肽复合物为基础制成肿瘤特异性的抗癌疫苗。 热休克蛋白HSP70(heatshockproteins70,HSP70)是热休克蛋白家族中最保守和最主要的一类，具有高度的保守性，在大多数生物中含量最多，在细胞应激后生成最为显著，因此HSP70成为热休克蛋白中最受关注、研究最深入的一种。 HSP70具有高度的保守性，根据HSP70氨基酸的一级结构可将HSP70分为3个功能区：(1)N端ATP酶结构域；(2)C端多肽结合区，由ATP酶活性区后大小为15KD的相对保守的氨基酸序列组成，是结合多肽或特殊蛋白的部位，类似MHC结合肽结构域，同源性及功能差异大；(3)一个不保守的近C端10KD的可变功能域。ATP的结合与水解似乎能调节HSP70对蛋白底物的亲和力，而多肽和未折叠的蛋白质可以促进其ATP酶活性。但是，当C端多肽结合区结合多肽功能域缺失后，这种促进作用随之丧失，说明这两个功能域对HSP70的分子伴侣功能是至关重要的。 HSP70具有分子伴侣功能，能与一些癌基因、抑癌基因产物相互作用，参与肿瘤细胞凋亡、细胞分化等。 近年来对肿瘤组织及细胞中HSP70的研究成为了热点，而要对HSP70进行研究须先获得高纯度的HSP70，但现有的对肿瘤组织和肿瘤细胞中HSP70的纯化的方法都不是太完善。 研究采用ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析的方法纯化HSP70，并对其进行鉴定，对从肿瘤组织和肿瘤细胞中纯化HSP70的方法作了必要的探讨，为进一步研究HSP70在肺癌免疫治疗中的作用奠定基础。 方法：1.细胞蛋白的获得：肿瘤细胞的获得是将A549细胞在体外37℃、体积分数为5％的CO2条件下，用含有体积分数为10％的胎牛血清的F-12K培养基进行培养、扩增，并进行离心收集。将约1×109个A549细胞置于10ml细胞裂解液(30mmol/LNaHCO3，0.1mmol/LEDTA，0.1mmol/LDTT，0.5mmol/L苯甲基磺酰氟，2mg/L抑肽酶)中，在冰水浴中用细胞超声破碎仪进行破碎，4℃、100000r/min超高速离心2h，吸取上清液。 2.HSP70的纯化：将ConA-Sepharose亲和层析柱用缓冲液A(20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，2mmol/LCaCl2，2mmol/LMgCl2，0.005mmol/LEDTA,1mmol/LMnCl2,pH7.5)进行平衡后，取上清液过ConA-Sepharose柱，收集不结合液体，4℃，缓冲液B(10mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，1mmol/Lβ-巯基乙醇，500mmol/LNaCl，pH7.5)中透析过夜。然后将样品加到用缓冲液B平衡过的ADP-agarose柱上缓慢过柱，用缓冲液B连续洗脱4个柱体积，将洗脱液置于缓冲液C(20mmol/LTris-HCl，20mol/LNaCl,0.1mmol/LEDTA，pH7.5)中在4℃透析过夜，将透析过的样品加到DEAE柱，用快速蛋白液相色谱系统进行分离，20～500mmol/LNaCl梯度洗脱，分别收集洗脱峰蛋白，4℃缓冲液D(10mmol/LTris-HCl，pH7.5)中透析过夜。 3.HSP70分子质量鉴定及免疫印迹检测：将各色谱柱分离的样品及DEAE柱的各洗脱峰样品在体积分数为12％的SDS-PAGE上进行分子质量检测及纯度测定，考马斯亮兰染色，或电泳后转移至硝酸纤维素膜上，以小鼠抗HSP70抗体为一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG为二抗，进行免疫印迹(Western-blot)分析. 结果：最终获得分子量为70000D左右，能与抗HSP70特异单抗结合的蛋白质纯品，并在纯化过程中延缓了ConA-Sepharose亲和层析柱柱效的降低、弃去了ADP二钠盐的使用及设计了一种手工操作的DEAE阴离子交换层析方法。 结论：1.采用ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析从肺腺癌A549细胞株中可获得高纯度的HSP70，为进一步研究以HSP70为基础的肺癌免疫治疗提供依据。 2.研究优化了肿瘤HSP70纯化的方法，解决了ConA-Sepharose亲和层析柱柱效容易降低的问题，在ADP-agarose亲和层析过程中弃去了ADP二钠盐的使用，并设计了一种手工操作的DEAE阴离子交换层析方法。

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HSP70与肿瘤

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