大鼠神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达及其调节

摘要

目的： 本实验旨在探讨大鼠神经干细胞诱导分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达以及Aβ<,25-5>和人参皂苷Rbl对它们的调节作用。 方法： 无菌条件下取新生24h大鼠海马齿状回分离培养神经干细胞，将第三代处于增殖期的神经干细胞，体外培养并加血清及撤除有丝分裂原诱导分化为神经细胞，运用免疫细胞化学染色方法检测神经干细胞特异性抗原Nestin和神经细胞标志物NSE及GFAP以评价分化细胞的阳性率。本实验采用分神经干细胞分化后1w的细胞进行实验分组：(1)正常组：不另加处理因素，继续培养36h；(2)Aβ<,25～35>处理组：不加处理因素，培养24h后，加入凝聚态Aβ<,25～35>(20μmol/L)继续培养12h；(3)人参皂苷Rbl预处理组：先加入人参皂苷Rbl(10μmol/L)预处理24h,再加入凝聚态Aβ<,25～35>(20μmol/L)继续作用12h。统一收集各组细胞进行实验检测。采用：RT-PCR技术检测神经干细胞分化过程中GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表达。同时应用流式细胞技术分析各组的细胞周期时相分布，观察不同处理组的细胞增殖情况。另外，应用免疫荧光细胞化学方法观察PP2A以及活化型GSK-3β(pTyr279,216)的表达。 结果： 1.自新生大鼠海马齿状回新鲜分离的单个神经干细胞呈透亮的圆形，数量较少，杂质较多。传至第3代(约3w左右)神经球明显增大，杂质已基本消除。细胞免疫化学染色发现，神经干细胞标记性蛋白Nestin在原代，传代培养神经球均有表达。神经干细胞诱导分化后3d，大多数悬浮状态生长的神经球开始贴壁，有的细胞呈毛刺状向外爬行。诱导分化7d后，贴壁神经干细胞团中有大量细胞阿外迁移，并形成长突起，相互交织成网状。免疫细胞化学检测显示，诱导分化后的神经细胞表达神经元特异性表面标志NSE和星形胶质细胞特异性表面标志GFAP。 2.流式细胞仪分析细胞周期时相，结果显示，Ap<,25～35>组和Rb1预处理组细胞均发生G0/G1期阻滞，细胞增殖受到抑制，且Aβ<,25～35>组细胞增殖能力下降更明显。 3.正常组细胞均有GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表达。Aβ<,25～35>组和Rb1预处理组都有强于正常组的GSK-3β和CDK-5的mRNA表达，且它们在Aβ<,25～35>组表达最强，统计分析有显著性差异(p<0.01)；而PP2A的mRNA在Aβ<,25～35>组和Rb1预处理组的表达都低于正常组，在Aβ<,25～35>组的表达最弱，统计分析有显著性差异(p<0.01)。 4.免疫荧光细胞化学染色结果显示：正常组细胞有PP2A的表达，Aβ<,25～35>组和人参皂苷Rb1预处理组细胞PP2A的表达均减弱，其中Aβ<,25～35>组最弱；而Aβ<,25～35>组和人参皂苷Rb1预处理组细胞内活化型GSK-3β(pTyr279，216)的表达均高于正常组，其中Aβ<,25～35>组表达最强。 结论： 1．体外培养的神经干细胞分化后有GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达； 2．Aβ<,25～35>和人参皂苷Rb1对体外培养的神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表达有调节作用

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材料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

综述 Tau蛋白与阿尔茨海默病

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