肿瘤相关抗原的抗体检测在原发性肝癌诊断中的价值

摘要

背景和目的：原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,特别是在亚洲和非洲。全球每年有60万人死于肝癌,我国每年有约32万人死于肝癌,其发病率和死亡率均占恶性肿瘤中的第二位。肝癌患者往往在确诊后一年内死亡,如此高的发病率和死亡率归因于缺乏一种早期诊断的方法。越来越多的研究发现肿瘤病人血清中存在有各种类型的抗细胞自身抗原的抗体,这些与肿瘤发生有关的抗原被称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA),对血清中存在的抗TAA抗体的检测可以用于肝癌的早期诊断和预后评价。肝癌的显著特征多由一些肝炎及肝硬化病人发展而来,研究者发现在一些从慢性肝炎、肝硬化而逐渐发展为肝癌的患者血清中,出现了在癌前病变前期没有的自身抗体。这就为肝癌的早期诊断提供了一个新的思路,但是单个抗体的灵敏度往往不高,有学者提出一个全新的概念,即把多种与肿瘤发生密切相关抗原的抗体系统结合起来综合考虑和评价其在肿瘤发生中的意义。
　　材料与方法：1.样本采集:研究对象共268例,分为两组,肝癌组115例,所有115例肝癌血清标本均采集自首次到医院就诊,并经组织病理学确诊、没有经过任何化疗和放疗的肝癌患者;正常组153例,正常对照均为进行健康体检并证实没有任何肿瘤相关疾患的健康成人。2.应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测115例原发性肝癌患者血清和153例正常人血清中的14种抗TAA(针对14个抗原Calnuc、CyclinE、CDK2、cIAP、RalA、p62、p53、CyclinB1、Koc、Impl、survivin、CyclinD1、p16、C-myc)的自身抗体,利用流行病学方法对检测结果的真实性进行评价。3.对本实验室经异体血清筛选出来的在肝癌患者、肝炎以及正常人中有差别的基因AHSG基因进行克隆。
　　结果一种抗原单独检测结果:1.大多数指标的灵敏度偏低,最高的为32.2％,但是肝癌患者抗体阳性率明显高于正常人。2.具有乙肝的肝癌患者、无肝炎(无乙肝和丙肝,简称无肝炎)的肝癌患者和正常人之间,灵敏度具有显著差异,具有乙肝的肝癌患者的抗体阳性率明显高于无肝炎肝癌患者和正常人的阳性率。抗原联合检测结果:1.14种TAA进行不同的组合,逐渐增加抗原数目进行检测,结果随着检测抗体的增多,灵敏度显著升高,抗原数目增加到8种(CyclinE、Koc、Impl、cIAP、p62、p16,Cyclin B1和Calnuc)时,灵敏度达到最高,本实验中,8种抗原组合为最适宜组合。联合8种TAA检测的灵敏度增加到72.2%,特异度达到91.2%,阳性似然比为8.49,阴性似然比为0.304,阳性预测值为86.5%,阴性预测值为81.4%,说明8种TAA联合检测肝癌的诊断价值较高;Kappa值为0.65,提示该试验的诊断结果与真实值之间中度一致。2.8种抗原联合检测在男女肝癌患者之间阳性率不存在差别。按年龄把肝癌患者分为三层,小于50岁,50岁到60岁之间,大于60岁,进行TAA联合检测,差别具有统计学意义,大于60岁组肝癌患者抗体阳性率最高。3.8种TAA联合检测和AFP检测肝癌之间差别无统计学意义,但是在AFP检测阴性的13例肝癌患者中,TAA检测有10例为阳性,把TAA检测和AFP检测进行并联筛检,肝癌检出率91.0%(32/35),远远高于AFP62.99%(22/35)和TAA的65.7%(23/35),且并联检测和AFP、TAA单独检测差别具有统计学意义。AHSG基因克隆结果:1.含AHSG基因的重组质粒pMD18-T-Ahsg(简称pTA),经双酶切后得到克隆载体片段(2.7kb)和目的基因AHSG片段(1104bp),特异PCR可扩增出1104bp的AHSG基因片段,证实AHSG基因的重组克隆质粒构建成功。经测序,AHSG基因全长1104bp,编码由367个氨基酸残基组成的肽链,蛋白质分子量为39KD,将AHSG测序结果采用NCBI的网上序列分析软件BLAST进行cDNA序列的同源性比较、分析,结果显示,发现有7个核苷酸差异,同源性为99%。
　　结论：1.用8种TAA抗体组合检测肝癌具有较高的真实性,可作为现场高危人群筛检和临床中肝癌诊断的一种方法。2.对于AFP诊断阴性的肝癌患者,联合检测具有一定的意义,可以做为AFP诊断的一种辅助的手段。3.成功构建了AHSG基因的重组质粒pMD18-T-AHSG(简称pTA),为下步重组蛋白的表达奠定了基础。

目录

中文摘要

Abstract

论文

第一部分 肿瘤相关抗原的抗体检测在原发性肝癌诊断中的应用

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 AHSG基因的克隆重组质粒的构建及鉴定

前言

材料与方法

结果与分析

讨论

结论

参考文献(REFERENCES)

综述

肿瘤相关抗原在肝癌免疫诊断中的应用

参考文献(REFERENCES)

附录I

附录II

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后记