PEG化免疫脂质复合物(PILP)介导双基因对实验性人肝癌的靶向性治疗研究

摘要

第一章 PEG化的免疫脂质复合物:用于肝癌基因治疗的新型非病毒基因递送系统
　　 目的:为了对肝癌进行基因治疗,我们研究了一种能够在体内将治疗基因递送至肝癌细胞中的高效、安全的非病毒基因递送系统。
　　 方法：聚乙二醇修饰的免疫脂质复合物(PILP),是一种新颖有效的非病毒基因递送系统。PILP由DNA/聚乙烯亚胺(PEI25 kDa)多聚物及阴离子脂质体组成。分别以五个不同脂质/DNA摩尔比(50/1,90/1,130/1,170/1和210/1)制备PILP。其中的阴离子脂质体由POPC,(DSPE)-PEG2000和(DSPE)-PEG2000-biotin组成,然后采用抗生物素-蛋白链菌素-单克隆抗体结合技术结合具寻靶作用的单克隆抗体。
　　 结果：该载体具有很强的保护质粒DNA不被核酸酶降解的能力,并且在4℃放置20天后,其粒径和电位稳定。以170/1的脂质/DNA摩尔比制备的PILP在体外有最高的转染效率,平均粒径和电位分别为132 nm,+9.5 mV。这些复合物毒性小并能有效地将基因转染肝癌细胞。4℃放置10天后,其体外转染效率无显著降低。用表达增强型绿色荧光蛋白和荧光素酶的质粒制备PILP,尾静脉给药,在体内表现出靶向肝和肿瘤的基因表达,而不同于PEI/DNA聚合物基因表达的肺部靶向性。
　　 结论：PILP是一种靶向肝细胞癌的基因递送载体。
　　 第二章靶向hEGFR mRNA和 hTERT mRNA小干扰联合基因治疗
　　 目的:将靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的shRNA-pDNA分别制备成PEG化的免疫脂质复合物(PILP),考察针对这两种基因联合治疗肝细胞癌的效果。
　　 方法：(1)将编码靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的小发夹RAN(shRNA)的表达质粒anti-hEGFR pDNA和anti-hTERT pDNA制备成免疫脂质复合物8314/shRNA-pDNA/PILP(8314/anti-unrelated pDNA/PILP,8314/anti-hEGFR pDNA/PILP和8314/anti-hTERT pDNA/PILP),PILP制备时,使用小鼠对人胰岛素受体的83-14单克隆抗体(8314 MAb)。体外转染肝癌SMMC-7721细胞,4天后,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,采用RT-PCR检测hEGFR基因水平。观察各组8314/shRNA-pDNA/PILP对hEGFR表达的抑制作用并于4个不同的时间点(2,4,6 day)观察8314/anti-hEGFR/PILP的时间-效应关系。(2)将2000,000个肝癌SMMC-7721细胞种于裸鼠背部皮下10天后,每5天静脉注射进行基因治疗,每只裸鼠尾静脉注射8314/shRNA-pDNA/PILP40μg,联合治疗组同时注射8314/anti-hEGFR/PILP和8314/anti-hTERT pDNA/PILP各40μg,记录各组荷瘤鼠存活时间,计算肿瘤抑制率。连续给药5次后,使用免疫组化和WesternBlot技术检测肿瘤组织的hEGFR蛋白水平,其基因水平检测使用实时定量RT-PCR法。
　　 结果：(1)将8314/anti-hEGFR pDNA/PILP复合物单独或与8314/anti-hTERT pDNA/PILP复合物共转染细胞可诱导hEGFR序列特异性基因沉默效应,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡得到了一致的结果。转染SMMC-7721细胞4天后,细胞周期结果表明8314/anti-hTERT pDNA/PILP处理组和共转染组的G0/G1期细胞百分数较对照组分别增加了17.62％和45.62％,进入S期的细胞百分数较对照组分别减少了35.49％和87.55％。细胞凋亡结果表明8314/anti-hEGFR pDNA/PILP处理组和共转染组细胞总凋亡率分别为12.47％和29.59％。与对照组比较,8314/anti-hTERT pDNA/PILP处理组和共转染组hEGFR基因水平分别下调了72.53％和78.68％。(2)体内基因治疗时,与对照组比,8314/anti-hEGFR pDNA/PILP处理组,8314/anti-hEGFRpDNA/PILP处理组和联合治疗组的肿瘤生长抑制率分别为36.32％,46.13％和74.04％。统计学结果表明:与对照组比,anti-hEGFR pDNA组,8314/anti-hEGFRpDNA/PILP处理组和联合治疗组对肿瘤生长有抑制作用且两单基因治疗组与联合治疗组间差异显著(P<0.05),其余各组之间无显著性差异(P>0.05)。荷瘤鼠生存时间在单基因治疗组与联合治疗组间的差别异有非常显著性意义(P=0.002)。其余各组之间无差异(P=0.707)。8314/anti-hEGFR pDNA/PILP处理组和联合治疗组可将hEGFR基因表达下调66.71％和89.01％,将hEGFR蛋白水平分别降低56.72％和80.73％。
　　 结论：体内外实验表明,靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的小干扰联合基因治疗较单基因治疗的抑瘤作用更显著,两者联合运用可产生显著增强效应。
　　 第三章 PILP介导的肝特异性shRNA-hTERT治疗实验性人肝癌的实验
　　 目的:构建肝特异性启动子载脂蛋白A-I(ApoAI)启动的靶向hTERTmRNA的治疗质粒,结合免疫脂质复合物(PILP)技术,实现有效和肝特异性的基因治疗,以减小非靶向性基因表达可能产生的副作用。
　　 方法：用ApoAI启动子分别替换增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pCMV-EGFP中的CMV启动子和靶向hTERT mRNA的治疗质粒PU6-shTERT(编码靶向hTERT mRNA内的1031-1059核苷酸序列的小发夹RNA)中的U6启动子,构建出质粒pApoAI-EGFP和pApoAI-shTERT。用ExGen500体外转染试剂将质粒分别瞬时转染HepG2,SMMC-7721,Lo2,MCF7,TF-1a,ACC-2和IMR90细胞:48 h后,荧光显微镜下观察EGFP的表达,72h后,测各处理组细胞的端粒酶活性。将质粒ApoAI-EGFP,CMV-EGFP,ApoAI-shTERT和U6-shEGFP分别制备成PILP,PILP通过受体特异性单克隆抗体(MAb),小鼠83-14 Mab对人胰岛素受体或大鼠8D3 MAb对小鼠转铁蛋白受体,靶向肝癌。将2000,000个肝癌SMMC-7721细胞种于裸鼠背部皮下后,从第10天开始,每5天静脉注射PILP进行小干扰基因治疗。
　　 结果：体外表达实验表明,转染pCMV-EGFP可导致EGFP在所有细胞中表达,而转染pApoAI-EGFP后,EGFP的表达仅出现在肝源性细胞中,包括HepG2,SMMC-7721细胞和正常肝细胞Lo2。pU6-shTERT处理可抑制所有端粒酶阳性的癌细胞的生长和端粒酶活性。pApoAI-shTERT。处理仅抑制端粒酶阳性的肝癌细胞的生长和端粒酶活性,对无端粒酶活性的正常肝细胞无抑制作用。荷H22瘤的小鼠体内基因表达实验表明:用pCMV-EGFP处理的小鼠,EGFP在其肝,肿瘤,脑和肺中有显著表达。而用ApoAI-EGFP处理的小鼠,EGFP仅在其肝和肿瘤中有报告基因的表达,非-肝器官中未检测到报告基因的表达。在荷SMMC-7721肿瘤的裸小鼠体内进行的RNA干扰基因治疗引起了29.28％的肿瘤生长抑制率,小鼠生存时间延长一半。
　　 结论：使用PILP技术和肝特异性启动子使外源基因有效的肝特异性表达和靶向hTERT mRNA的肝特异性的RNA干扰基因治疗成为可能。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前言

第一章 PEG化的免疫脂质复合物研究

1.1 实验材料

1.1.1 质粒、菌株

1.1.2 细胞和动物

1.1.3 主要试剂

1.1.4 试剂配制

1.2 实验方法

1.2.1 质粒DNA的扩增

1.2.2 质粒DNA的提取和纯化

1.2.3 质粒DNA的含量和纯度分析

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳

1.2.5 DNA/PEI聚合物的制备

1.2.6 空白脂质体的制备

1.2.7 PEG化脂质复合物(PLP)的制备

1.2.8 PEG化免疫脂质复合物(PILP)的制备

1.2.9 PILP粒径和电位的测定及其形态学观察

1.2.10 PILP的抗酶切实验

1.2.11 PILP的稳定性实验

1.2.12细胞培养

1.2.13 8314/EGFP/PILP在SMMC-7721细胞中的表达

1.2.14 MTT法测PILP对细胞活性的影响

1.2.15 PILP在体内介导的EGFP和荧光素酶报告基因的表达

1.2.16统计分析

1.3 实验结果

1.3.1 质粒DNA的含量和纯度

1.3.2 粒径、电位和稳定性评价

1.3.3 8314/EGFP/PILP在SMMC-7721细胞中的表达

1.3.4 MTT法测PILP对细胞活性的影响

1.3.5 PILP介导的体内基因表达结果

1.4 讨论

第二章 靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA小干扰联合基因治疗

2.1 实验材料

2.1.1 质粒、细菌、细胞

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 试剂配制

2.1.5 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 相关pDNA的PILP的制备

2.2.3 细胞接种与细胞转染

2.2.4 治疗质粒转染肝癌细胞SMMC-7721后hEGFR的表达变化

2.2.5 检测细胞周期相分布和细胞凋亡

2.2.6 荷瘤鼠模型的建立和给药

2.2.7 肿瘤生长抑制率和生存研究

2.2.8 肿瘤标本的评价方法

2.2.9 实验结果的统计学分析

2.3 实验结果

2.3.1 总RNA的纯度和完整性分析

2.3.2 实时荧光定量RT-PCR扩增产物鉴定

2.3.3 实时荧光定量RT-PCR的扩增效率检测

2.3.4 肝癌细胞SMMC-7721中bEGFR mRNA的表达

2.3.5 肝癌细胞SMMC-7721周期和凋亡检测

2.3.6 SMMC-7721I细胞的成瘤率测定

2.3.7 肿瘤生长抑制率和生存实验

2.3.8 实时定量RT-PCR检测bEGFR mRNA表达

2.3.9 Western Blot检测hEGFR蛋白表达

2.4 讨论

第三章 PILP介导的肝特异性shRNA-hTERT治疗实验性人肝癌的实验

3.1 实验材料

3.1.1 质粒、细胞和动物

3.1.2 主要试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 免疫脂质复合物(PILP)的制备和检测

3.2.2 pApoAI-EGFP的体外不同细胞系的表达

3.2.3 端粒酶活性检测

3.2.4 MTT法分析细胞活性

3.2.5 pApoAI-EGFP的体内表达

3.2.6 pApoAI-shTERT对裸鼠生存时间和肝癌移殖瘤生长的影响

3.2.7 不同处理组对裸鼠肝癌移植瘤内hTERT mRNA的影响

3.2.8 ApoAI-shTERT对裸鼠肝癌移植瘤细胞端粒酶活性的抑制

3.2.9 实验结果的统计学分析

3.3 实验结果

3.3.1 肝靶向性pApoAI-EGFP质粒的细胞实验

3.3.2 肝靶向性pApoAI-shTERT的细胞实验

3.3.3 体内ApoAI-EGFP载体的表达实验

3.3.4 ApoAI-shTERT载体的抑瘤作用

3.4 讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢