全反式维甲酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-468,MCF-7增殖和凋亡及BP1表达影响的研究

摘要

乳腺癌已成为当代女性肿瘤性疾病中发病率最高的肿瘤,严重威胁着女性的健康甚至生命。尽管手术、化疗和放疗手段有了长足的进步,大多数的患者仍然最终出现复发、转移,致使治疗失败。
　　 肿瘤细胞的诱导分化和促分化治疗作为肿瘤治疗的一条新的抗肿瘤途径,近年以此为中心的研究非常活跃。维甲酸类化合物可将具有无限增殖潜能的恶性细胞逆转为具有正常分化功能的细胞,是近年来肿瘤治疗的热点之一。维甲酸类化合物作为确切的诱导分化剂,其在白血病方面的临床应用,疗效己是十分确切。但在实体肿瘤包括乳腺癌的研究报道很少。因此寻找体外高效、低毒的诱导分化剂势在必行。
　　 本研究应用全反式维甲酸作用于不同雌激素受体类型的人乳腺癌细胞MDA-MB-468及MCF-7,运用流式细胞术、免疫化学技术、TUNEL、PCR等分子生物学技术,观察比较两种人乳腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的改变,并检测BP1基因及凋亡相关蛋白、细胞信号转导通路中蛋白的表达,探讨其发生机制,为药物治疗乳腺癌开拓新的思路。本研究分为以下三部分:
　　 第一部分全反式维甲酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-468,MCF-7增殖抑制,诱导凋亡和周期阻滞的研究
　　 目的
　　 研究全反式维甲酸(ATRA)对体外培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-468、MCF-7增殖、凋亡和周期分布的影响
　　 材料和方法：
　　 将体外培养的人乳腺癌细胞随机分为6组:空白对照组；10-3mol/LATRA组；10-4mol/L,ATRA组；10-5mol/LATRA组；10-6mol/L ATRA组；10-7mol/L ATRA组。加入药物进行干预后,分别于24h、48h、72h、96h、120h及144h收集各组细胞。应用MTT比色法绘制细胞生长曲线及计算细胞增殖抑制率；TUNEL法、流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布情况。
　　 结果：
　　 1.ATRA作用两种人乳腺癌细胞后其增殖活性受到明显抑制,在不同浓度组间,不同时间组间比较,增值抑制率均存在差异,差异有统计学意义(P<0.05).存在时间依赖性及浓度依赖性。同对照组相比,经过不同浓度ATRA作用后,各实验组乳腺癌细胞均表现为生长速度减缓,抑制率增强,其抑制率同物浓度和作用时间呈正相关关系。在相同ATRA浓度及相同作用时间下ER阴性表达(ER-)细胞系MDA-MB-468抑制率较ER阳性表达(ER+)细胞MCF-7高,差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　 2.光学显微镜下,实验组细胞的形态学发生改变,随药物浓度及作用时间延长而更为显著.
　　 3.TUNEL检测结果显示,人乳腺癌细胞MDA-MB-468及MCF-7凋亡指数随药物作用时间延长而增加,在72h可达(32.93±1.512)％、(12.38±1.728)％,与未处理组相比,差异有统计学意义(P<0.05),MDA-MB-468细胞显著高于MCF-7细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 4.流式细胞术结果显示,ATRA干预两种人乳腺癌细胞后,其细胞周期和凋亡率均发生改变:与对照组相比,10-5mol/LATRA干预后,G0/G1期细胞比例逐渐增加,而G2/M、s期细胞比例相应减少；同时,细胞凋亡率也逐渐升高,作用72h后,早期凋亡率可达(11.53±1.618)％、(6.22±0.731)％,较对照组均有升高,差异有统计学意义(P<0.05)；G0/G1期比例和凋亡率的增加与药物作用时间呈正向变化关系。ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡率升高更为显著。
　　 结论：
　　 1.ATRA可以抑制体外培养的人乳腺癌细胞的增殖,呈时间及剂量依赖性。
　　 2.ATRA通过阻滞人乳腺癌细胞生长周期于G0/G1期,并诱发其凋亡而抑制细胞生长,诱导肿瘤细胞分化,降低其侵袭性,存在时间依赖性。在一定的药物浓度范围内,增加药物浓度或延长作用时间可增强药物肿瘤抑制效应。ATRA诱导的细胞凋亡在ER(-)人乳腺癌细胞中更为显著。
　　 3.ATRA可做为治疗乳腺癌的抗肿瘤药物。
　　 第二部分全反式维甲酸对人乳腺癌细胞中BP1、Survivin及stat3表达影响的研究
　　 目的
　　 研究体ATRA作用外培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-468及MCF-7后BP1基因mRNA及其蛋白表达的影响,同时平行检测凋亡相关蛋白Survivin及Stat3表达水平的变化,探讨ATRA抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制。
　　 材料和方法：
　　 同前进行细胞培养,应用筛选出的药物浓度进行药物干预,分别于培养24h、48h和72h后,应用RT-PCR法半定量检测BP1mRNA表达水平改变,并应用免疫细胞化学法检测BP1、Survivin及信号转导蛋白Stat3蛋白的表达变化。
　　 结果：
　　 1.人乳腺癌细胞中MDA-MB-468及MCF-7中BP1mRNA表达水平存在差异,具有统计学意义(P<0.05)。经ATRA作用后人乳腺癌细胞BP1mRNA表达水平下降,于对照组相比,各时间组细胞BP1mRNA电泳条带光密度比率(ODR)值逐渐降低。ATRA作用24h,48h,72h后,BP1mRNA表达水平呈下降趋势,各时间组间存在显著性差异(P<0.05),ODR值同作用时间成负相关。ER(-)人乳腺癌细胞MDA-MB-468中BP1mRNA表达下调更为明显。
　　 2.在MDA-MB-468及MCF-7细胞中,ATRA作用后Survivin及Stat3mRNA表达均下调,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 3.经ATRA作用后人乳腺癌细胞BP1、Survivin及Stat3蛋白的表达均呈下降趋势；同对照组相比,经10-5mmol/LATRA作用24h、48h及72h后,BP1蛋白表达水平均有显著下降(P<0.05)；同ER(+)乳腺癌细胞系相比,ER(-)乳腺癌细胞系MDA-MB-468中下调更为明显。
　　 4.ATRA可抑制人乳腺癌细胞系中BP1、Survivin和Stat3 mRNA及蛋白表达,三者下调具有同步性。
　　 结论：
　　 1.人乳腺癌细胞MDA-MB-468及MCF-7中BP1基因表达下调,可能参与了ATRA抑制细胞增殖并促进其凋亡的过程。在一定范围内,增加药物浓度或延长药物作用时间可增强此效应。
　　 2.Survivin及Stat3参与了ATRA对人乳腺癌细胞的增殖抑制及促凋亡作用；
　　 3.ATRA可能通过Survivin、Stat3通路调控BP1基因表达；
　　 4.BP1基因及蛋白可以做为原癌基因进行更为深入的研究,同时可作为乳腺癌治疗的靶点。
　　 第三部分BP1、C-erbB-2在乳腺癌组织中表达及其在乳腺癌的发生发展及侵袭转移的相关性研究
　　 目的
　　 检测乳腺癌组织,配对癌旁和正常乳腺组织中BP1,C-erbB-2的蛋白水平表达规律,探讨其在乳腺癌发生、发展中的意义,更好的明确乳腺癌的发病机制,为乳腺癌的早期诊断,治疗及预后提供更多的分子指标。
　　 材料和方法：
　　 运用RT-PCR.技术检测74乳腺癌组织、配对癌旁和正常乳腺组织中BP1mRNA的表达差异及相关,并运用双重免疫组织化学化技术检测BP1、C-erbB-2蛋白的表达情况。分析两者同乳腺癌临床病理指标的关系,并探讨两个指标之间的相关性。
　　 结果：
　　 1.RT-PCR结果显示:74例乳腺癌、配对癌旁及正常组织中BP1 mRNA阳性表达率分别为64.8％(48/74)、8.1％(6/74)和1.3％(1/74)。乳腺癌标本中BP1mRNA阳性表达率显著高于癌旁及正常乳腺组织(P<0.05)。BP1的表达与肿瘤临床分期、病理学分级、雌激素受体等临床病理学参数之间存在显著的相关性。雌激素受体阴性的乳腺癌组织中,BP1的阳性表达率92.3％(24/26)显著高于雌激素受体阳性的乳腺癌组织47.9％(23/48)(P<0.05),且BP1的表达水平随肿瘤临床分期的升高而升高,双重免疫组化检测BP1蛋白结果和PCR结果吻合,呈现一致的变化趋势。
　　 2.乳腺癌中C-erbB-2蛋白阳性表达率是48.6％(36/74),显著高于配对癌旁及正常乳腺组织(P<0.05)。C-erbB-2蛋白表达率在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组,临床分期Ⅲ期组显著高于Ⅰ、Ⅱ期组(P<0.05)。浸润性癌组织中显著高于原位癌组及正常乳腺组织。
　　 3.相关性分析显示:BP1与C-erbB-2蛋白阳性表达率之间均存在显著关联(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.BP1基因表达水平与乳腺癌的发生密切相关,且与肿瘤临床分期、病理学分级、雌激素受体等临床病理学参数之间存在显著的相关性。双重免疫组化技术检测乳腺癌组织BP1蛋白的表达水平,结果和RT-PCR实验结果相一致,
　　 2.C-erbB-2蛋白阳性表达与乳腺癌临床分期、病理学分级、淋巴结转移关系密切,提示C-erbB-2蛋白的表达水平与乳腺癌侵袭转移能力呈正相关。
　　 3.BP1与C-erbB-2蛋白阳性表达率之间存在显著性关联,提示可能通过C-erbB-2基因发挥其在乳腺癌发生发展过程中的作用。
　　 4.对乳腺癌中BP1,C-erbB-2的表达水平进行检测,可以判断其恶性行为,预测浸润和转移的潜能,为临床治疗提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 全反式维甲酸对人乳腺癌细胞,MDA-MB-468,MCF-7增殖抑制,诱导凋亡和周期阻滞的研究

前言

实验目的

材料方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第二部分 全反式维甲酸对人乳腺癌细胞中BP1、Surivin及Stat3表达影响的研究

前言

实验目的

材料方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第三部分 乳腺癌中BP1、C-erbB-2表达与肿瘤的发生发展及侵袭转移的相关性研究

前言

材料方法

实验目的

结果

讨论

小结

附图

参考文献

综述 维甲酸类化合物抗肿瘤机制研究进展

参考文献

缩略词

攻读博士学位期间发表的论文

致谢